Tập 29, số 6 - 2019
Vietnam Journal of Preventive Medicine
SỐ ĐẶC BIỆT
BỆNH VIỆN PHONG – DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HOÀ
HỘI Y HỌC DỰ PHÒNG VIỆT NAM XUẤT BẢN
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA CÁC CHỦNG MYCOBACTERIUM LEPRAE THU THẬP ĐƯỢC Ở BỆNH VIỆN PHONG - DA LIỄU TRUNG ƯƠNG QUY HÒA
Châu Hồ Tịnh Tâm1*, Nguyễn Phúc Như Hà1, Nguyễn Hoàng Bách2, Lê Văn An2, Antonella Santona3, Pietro Capuccinelli3
1Bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa, Quy Nhơn, Bình Định
2Trường Đại học Y Dược Huế
3Trường Đại học Sassari, Italy
TÓM TẮT
Bệnh phong là một bệnh truyền nhiễm mãn tính gây ra bởi Mycobacterium leprae, còn được gọi là trực khuẩn Hansen. Đây là loại vi khuẩn không thể nuôi cấy, đã trải qua quá trình tiến hóa đáng kể với một nửa bộ gen của nó là các pseudogene được bảo tồn cao, điều này rất hữu ích cho mục đích xác định kiểu gen, tìm hiểu về dịch tễ bệnh phong, xác định nguồn gốc cũng như nguyên nhân gây bệnh. Các phương pháp xác dịnh kiểu gen khác nhau đã được phát triển, trong nghiên cứu này chúng tôi xác định kiểu gen của M.
leprae ở một số bệnh nhân phong tại các tỉnh miền Trung và Tây nguyên Việt Nam dựa trên đa hình các nucleotide đơn (SNPs) và đa hình gen rpoT. Hai mươi bảy mẫu M. leprae được xác định bằng real-time PCR. Kết quả cho thấy 56% các mẫu thu thập thuộc loại 1, 44% thuộc loại 3. Ngoài ra, tất cả các mẫu đều có kiểu gen hexamer 3 bản sao điển hình trong gen rpoT. Kết quả của chúng tôi góp phần vào việc tìm hiểu dịch tễ học bệnh phong ở miền Trung Việt Nam.
Từ khóa: Mycobacterium leprae; genotyping; SNP; rpoT gene
Ngày gửi bài: 01/07/2019 Ngày phản biện: 15/07/2019 Ngày đăng bài: 16/08/2019
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh phong là một bệnh nhiễm trùng u hạt mạn tính ở da và dây thần kinh ngoại biên với vi khuẩn nội bào Mycobacterium leprae. Bệnh phong vẫn là một vấn đề sức khỏe quan trọng trên toàn thế giới, là một trong những bệnh được ghi nhận lâu đời nhất của loài người.
Bệnh phong được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới; 215.656 bệnh nhân mới được thống kê bởi WHO vào năm 2013.
Kiểu gen của các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm là rất cần thiết để phân tích dịch tễ học di truyền. Việc xác định type sẽ là cơ sở hỗ trợ đáng kể không chỉ cho nghiên cứu sự phân bố toàn cầu và địa lý của các chủng khác nhau của M. leprae mà còn giúp hiểu thêm về mối tương quan giữa M. leprae và các biểu hiện bệnh, cung cấp tầm nhìn sâu sắc về lịch sử và sự tiến hóa của trực khuẩn đã ảnh hưởng đến con người và sự kỳ
thị bệnh nhân phong trong nhiều thế kỷ [1]. Hiện đã có một số dấu hiệu mục tiêu đầy hứa hẹn để tìm ra sự khác biệt giữa các chủng M. leprae là TTC [2], rpoT [3,4], VNTRs [5,6] và SNPs [1,7].
Mục đích của nghiên cứu này là mở rộng phân tích phân bố địa lý của M. leprae bằng cách xác định kiểu gen SNP và rpoT ở các chủng phân lập từ mẫu lâm sàng của các tỉnh miền Trung Việt Nam. So sánh các kiểu gen SNP và rpoT từ các chủng thu thập được với các chủng từ các quốc gia châu Á khác để cung cấp bức tranh tổng thể hơn về sự phân bố và lây truyền bệnh phong ở Việt Nam nói riêng và trong khu vực châu Á nói chung.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu (từ phết tế bào da hoặc sinh thiết)
*Tác giả: Châu Hồ Tịnh Tâm
Địa chỉ: Bệnh viện Phong- Da liễu Trung ương Quy Hòa Điện thoại: 0944 471 559
Email: chauhotinhtam@gmail.com
được lấy từ các bệnh nhân phong ở các khu vực miền Trung và Tây nguyên của Việt Nam.
Tổng số 27 mẫu được sử dụng trong nghiên cứu này. Các mẫu được lấy từ các tổn thương trên da của bệnh nhân (dịch phết hoặc sinh thiết ngâm trong 1 ml ethanol 70% ở nhiệt độ phòng, trước khi được gửi đến phòng xét nghiệm Sinh học Phân tử của Bệnh viện Phong - Da liễu TW Quy Hòa). Các mẫu sinh thiết được giữ ở -200C cho đến khi được xử lý để tách chiết DNA.
2.2 Phương pháp Tách chiết DNA:
Tổng cộng có 27 chủng M. leprae đã được sử dụng để phân tích SNP và rpoT. DNA được tách chiết từ các mẫu bằng cách sử dụng bộ kit Qiagen DneasyTM Blood and Tissue kit (Qiagen, CA). Việc tách chiết DNA được thực hiện theo quy trình hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Các mẫu DNA hòa tan trong 100 μL dung dịch đệm TE được cung cấp kèm theo bộ kit. Các mẫu DNA được lưu trữ ở -800C cho
đến khi sử dụng.
Kỹ thuật Realtime PCR:
Real-time PCR được thực hiện bằng cách sử dụng mồi xuôi (5’-GCAGTATCGTGTTAGT- GAA-3’), mồi ngược (5’-CGCTAGAAGGTTG- CCGTATG-3’) và TaqMan probe (5’ FAM-TC- GATGATCCGGCCGTCGGCG-TAMRA 3’), như được mô tả bởi Truman và cộng sự [8].
Gene đích RLEP được khuếch đại để khẳng định mẫu dương tính với M.leprae.
Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR: 50oC trong 2 phút, 95oC trong 5 phút, 40 chu kỳ (95oC trong 15 giây, 60oC trong 1 phút).
Định type dựa trên SNP:
Các mẫu DNA sau khi được xác định dương tính với RLEP sẽ thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại 3 đoạn gen có chứa các nucleotide ở vị trí lần lượt là 14676, 642875 and 2935685.
Phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đã được mô tả ở các bài báo trước đó [1, 9].
Bảng 1. Các trình tự mồi (primer) sử dụng cho xác định SNP SNP14676 5’-AATGGAATGCTGGTGAGAGC-3’
5’-CAATGCATGCTAGCCTTAATGA-3’ 194
SNP164275 5’-CTCGTCACAAATCCGAGTTTGAAT-3’
5’-GTAGTAGTCTTCCAAGTTGTGGTG-3’ 114
SNP2935685 5’-ATCTGGTCCGGGTAGGAATC-3’
5’-ACCGGTGAGCGCACTAAG-3’ 180
Chuẩn bị dung dịch khuếch đại với 0.4 μM cho mỗi mồi; 12.5 dung dịch Hot start PCR mix (LeGene Biosciences, USA), thêm vào 5µl sản phẩm DNA). Thể tích cuối cùng của dung dịch khuếch đại là 25µl.
Chương trình khuếch đại gồm giai đoạn biến tính đầu tiên ở 950C trong 5 phút, tiếp theo thực hiện khuếch đại trong 40 chu kỳ với 950C trong 30 giây, giai đoạn bắt cặp ở 580C trong 30 giây và giai đoạn tổng hợp kéo dài ở 720C trong 30 giây, cuối cùng là 720C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit DNA clean and concentrator TM-5
(Zymoresearch, USA), tiếp theo là kiểm tra và xác định nồng độ bằng điện di trên gel agarose sử dụng Low mass marker (Invitrogen). Cuối cùng, sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự ở LMU (http://www.gi.bio.lmu.de/sequencing), Đức cùng với mồi đã sử dụng trong PCR. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Geneious Pro 4.8.4.
Định type dựa trên gen rpoT:
Cặp mồi A (5’- ATGCCGAACCGGACCTC- GACGTTGA-3’) và B (5’-TCGTCTTCGAG- GTCGTCGAGA-3’) đã được mô tả trước đó [3], được sử dụng để khuếch đại đoạn gen dài
Vùng lặp lại 6 nucleotide trên gen rpoT được khuếch đại bằng PCR và được phân tích bằng điện di. Tất cả các sản phẩm khuếch đại
thu được đều có kích thước 91-bp, mà không phải là 97-bp.
91 hoặc 97-bp chứa vùng gen đích với 3 bản sao lặp lại hoặc 4 bản sao lặp lại trong gene. Để so sánh sự khác nhau về sự lặp lại trong gene rpoT, sản phẩm PCR 91- hoặc 97-bp được phân tách bằng điện di sử dụng 4% Meta Phoree aga- rose gel (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) và dung dịch đệm TAE buffer ở điện thế 50 V.
2.3 Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học. Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật. Đề tài nghiên cứu
đã được chấp thuận bởi Hội đồng Y đức của trường Đại học Y dược Huế.
III. KẾT QUẢ
3.1 Định type dựa trên SNP
Các type SNP của mẫu được xác định trong nghiên cứu này bao gồm SNP type 1, CGA và SNP type 3, CTC. Trong tổng số 27 mẫu, 15 mẫu thuộc SNP type 1 (56%), trong khi đó type 3 được tìm thấy trong 12 mẫu (44%). SNP type 2 và type 4 không được tìm thấy trong số các chủng nghiên cứu này.
Hình 1. Sự phân bố của các type SNP trên bản đồ địa lý
3.2 Định type dựa trên gen rpoT
IV. BÀN LUẬN
Các loại SNP được xác định dựa trên tính đa hình của nucleotide tại các vị trí 14676, 164275 và 2935685 của DNA M. leprae genomic. Bốn loại type SNP- type 1, CGA; type 2, CTA; type 3, CTC; và type 4, TTC- đã được công bố trong các bài báo trước đó [1]. Bên cạnh đó, gen rpoT cũng khác nhau về số lần lặp lại các nucleotide và loại 3 bản sao (91 bp) đã được tìm thấy ở hầu hết các chủng M. leprae bao gồm cả chủng TN Indian, loại 4 bản sao (97 bp) được tìm thấy ở các nước Đông Á như Nhật Bản và Hàn Quốc [3, 4]. Trong nghiên cứu này, tất cả các mẫu thu thập được đều thuộc SNP type 1 và 3 với tỉ lệ 15:12. Thêm vào đó, tất cả mẫu đều có 3 bản sao 6 nucleotide lặp lại trong gene rpoT.
Kết quả này tương tự với nghiên cứu ở Thái Lan [10]. Monot và CS trước đây đã mô tả sự phân loại bốn type M.leprae dựa trên việc phát hiện ra ba SNP. M. leprae SNP type 1 đã được chứng minh là phổ biến ở châu Á (Nepal, Ấn Độ, Hàn Quốc, Thái Lan và Philippines), các đảo New Caledonia và Đông Phi ở Thái Bình Dương, trong khi type 3 được tìm thấy ở châu Âu, Bắc Phi, lục địa Mỹ và cả ở New Caledonia [1]. Matsuoka và CS đã so sánh Mycobacterium leprae phân lập từ Nhật Bản với các nước châu
Á khác. Vì vậy, có thể thấy rằng tần số SNP type 1, 3 và loại 3 bản sao trên gene rpoT là phổ biến giữa Myanmar và Philippines [7, 11], trong khi đó SNP type 2 được nhận diện ở Myanmar nhưng không có trong các chủng ở Việt Nam, Thái Lan và Philippine. Loại 4 bản sao trên rpoT có thể tìm thấy ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Indonesia [7, 12]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên mẫu bệnh phẩm thu thập được phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đây, điều đó chứng minh rằng sự lặp lại trong gene rpoT và SNP được bảo tồn đáng kể và điều này rất hữu ích để nghiên cứu sự phân bố địa lý của M. leprae trong khu vực hoặc ở cấp độ toàn cầu.
Một hạn chế của nghiên cứu này là số lượng mẫu nghiên cứu nhỏ. Do đó, cần có các nghiên cứu bổ sung được thực hiện trong khu vực này và các khu vực khác của Việt Nam để cải thiện hiểu biết về dịch tễ học của M. leprae tại Việt Nam.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu này chỉ ra hai kiểu gen, SNP loại 1 (56%) và SNP loại 3 (44%) có ở miền Trung và Tây Nguyên của Việt Nam, trong khi
Hình 2. Hình ảnh điện di của sản phẩm PCR khuếch đại trên gene rpoT. Giếng 1, 15: maker 10bp;
giếng 2-14: mẫu
các chủng SNP loại 2 và SNP loại 4 không được tìm thấy. Ngoài ra, tất cả các mẫu đều chứa 3 bản sao 6 nucleotide lặp lại trong gen rpoT. Sự kết hợp này giống với mô tả trước đây ở Thái Lan và Nhật Bản cho thấy nguồn gốc chung của các chủng M.leprae.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Monot M, Honoré N. On the Origin of Leprosy.
Science 2005; (80): 324.
2. Shin YC, et al. Variable numbers of TTC repeats in Mycobacterium leprae DNA from leprosy patients and use in strain differentiation. J Clin Microbiol. 2000; 38: 4535–4538.
3. Matsuoka M, Maeda S, Kai M, Nakata N.
Mycobacterium leprae Typing by Genomic Diversity and Global Distribution of Genotypes.
Int J Lepr.2000; 68, 1–5.
4. Matsuoka M, Zhang L, Morris MF, Legua P, Wiens C. Polymorphism in the rpoT gene in Mycobacterium leprae isolates obtained from Latin American countries and its possible correlation with the spread of leprosy. FEMS Microbiol Lett 2005; 243: 311–315.
5. Groathouse NA, et al. Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium
leprae. J Clin Microbiol.2004; 42: 1666–1672.
6. Truman R, Fontes AB, De Miranda AB, Suffys P, Gillis T. Genotypic variation and stability of four variable-number tandem repeats and their suitability for discriminating strains of Mycobacterium leprae. J Clin Microbiol.2004;
42: 2558–2565.
7. Matsuoka M, Lopez Roa RI, Budiawan T, Kyaw K, Chae GT. Genotypic analysis of Mycobacterium leprae isolates from Japan and other Asian countries reveals a global transmission pattern of leprosy.
FEMS Microbiol Lett. 2006; 261:150–154.
8. Truman RW, et al. Enumeration of Mycobacterium leprae using real-time PCR. PLoS Negl Trop Dis.
2008; 2.
9. Monot M, et al. Comparative genomic and phylogeographic analysis of Mycobacterium leprae. Nat Genet.2009; 41: 1282-U39.
10. Phetsuksiri B, et al. SNP genotypes of Mycobacterium leprae isolates in Thailand and their combination with rpoT and TTC genotyping for analysis of leprosy distribution and transmission. Jpn J Infect Dis. 2012; 65:52–56.
11. Sakamuri RM, et al. Population-based molecular epidemiology of leprosy in Cebu, Philippines. J Clin Microbiol. 2009; 47: 2844–2854.
12. Chae GT, et al. Typing of clinical isolates of Mycobacterium leprae and their distribution in Korea. Lepr Rev 2002; 73: 41–6.
GENOTYPING OF MYCOBACTERIUM LEPRAE STRAINS COLLECTED AT QUY HOA DERMATOLOGY HOSPITAL, BINH DINH PROVINCE, VIETNAM
Chau Ho Tinh Tam1, Nguyen Phuc Nhu Ha1, Nguyen Hoang Bach2, Le Van An2, Antonella Santona3, Pietro Capuccinelli3
1Quy Hoa National Dermatology Hospital, Quy Nhon, Binh Dinh
2Department of Medical Microbiology, HUMP
3Sassari University, Italy
Leprosy remains an important health problem worldwide, it is one of the oldest recorded diseases of humankind. Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, also known as Hansen’s bacillus. This unculturable pathogen that has undergone extensive reductive evolution, with half of its genome now occupied by highly conserved pseudogenes, useful for genotyping purpose, for understanding leprosy epidemiology, identifying source as well as causes of persisting foci of disease. Different genotyping methods have been developed, in this study we determinated the genotypes of M.
leprae isolated from selected leprosy patients from different province of central regions of Vietnam based on pseudogene (SNPs) and rpoT gene polymorphism. Twenty-seven M. leprae isolated from clinical specimens were identified by real-time PCR. Results evidenced that 56% of isolates belonged to type 1 and remained 44% belonged to type 3.
In addition, all samples had the typical 3-copy hexamer genotype in the rpoT gene. Our results contribute to understand the epidemiology of leprosy in central Vietnam.
Keywords: Mycobacterium leprae;
genotyping; SNP; rpoT gene.
