NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT BERBERIN TỪ THÂN, RỄ CÂY VÀNG ĐẮNG BẰNG DUNG DỊCH KIỀM
Đồng Quang Huy1*, Nguyễn Quốc Thịnh1, Lê Thu Hoài2 1Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên, 2Trường Cao đẳng Y tế Thái Nguyên
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất berberin từ thân, rễ cây vàng đắng ở quy mô phòng thí nghiệm.
Phương pháp: Áp dụng các phần mềm thông minh trong nghiên cứu quy trình chiết xuất gồm: Thiết kế mô hình thực nghiệm D-Optimal bằng phần mềm Modde, phân tích các yếu tố ảnh hưởng bằng phần mềm FormRules và tối ưu hóa thông số bởi phần mềm INForm và thực nghiệm kiểm chứng.
Kết quả: Dữ liệu phân tích cho thấy khối lượng và hàm lượng berberin bị ảnh hưởng bởi 3 yếu tố khảo sát là nồng độ nước vôi, tỷ lệ dược liệu/dung môi và thời gian chiết
Kết luận: Các thông số tối ưu của quy trình đã được xác định bao gồm: Nồng độ nước vôi (4,2%), tỷ lệ dược liệu/dung môi (1/8) và thời gian chiết (11,6 giờ).
Từ khóa: chiết xuất, berberin, vàng đắng, Modde, FormRules, INForm.
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Việt Nam chúng ta là một nước giàu tiềm năng cây thuốc. Trong những năm gần đây xu hướng trên thế giới dùng thuốc từ dược liệu ngày càng tăng lên, việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để ngành công nghiệp dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược liệu.
Vàng đắng là một cây thuốc quý, mọc hoang chủ yếu ở các nước vùng nhiệt đới. Ở nước ta, cây mọc phổ biến ở miền Đông nam bộ, Nam trung bộ, Tây nguyên. Trong dân gian, vàng đắng thường được dùng để chữa lị, đau mắt, viêm ruột [6]. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng berberin có tác dụng chống ung thư, làm giảm lượng cholesterol, kháng nấm, kháng virus... Đặc biệt hơn cả, berberin có tác dụng làm giảm đường huyết và giảm kháng insulin đối với bệnh tiểu đường tuýp II [7]. Vì vậy hiện nay, nhu cầu sử dụng các chế phẩm có berberin ngày càng lớn, mà công nghiệp tổng hợp hóa dược chưa sản xuất được. 100%
berberin trên thị trường hiện nay được sản xuất bằng cách chiết xuất từ dược liệu.
Đã có một số nghiên cứu về phương pháp chiết xuất berberin như phương pháp chiết berberin từ vàng đắng bằng dung dịch acid sulfuric 0,4% [5], hay phương pháp chiết berberin bằng ethanol 96o [3]. Hiện nay chủ yếu dùng dung dịch acid sulfuric loãng để chiết xuất, tuy nhiên quy trình chiết vẫn còn một số nhược điểm như: Kéo dài thời gian, tốn nhiều dung môi, dịch chiết lẫn nhiều tạp khó tinh chế, hiệu suất chiết thấp, đòi hỏi thiết bị chiết chịu được acid…
Với mong muốn nâng cao hiệu suất chiết xuất chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất berberin từ thân, rễ cây vàng đắng bằng dung dịch kiềm". Mục tiêu đề tài nhằm xây dựng được quy trình tối ưu chiết xuất berberin từ vàng đắng bằng dung dịch kiềm với sự hỗ trợ của các phần mềm thông minh [1], sao cho khối lượng và hàm lượng hoạt chất đánh giá dựa vào berberin cao nhất.
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu
Vàng đắng thu mua tại huyện Đắk Nông, tỉnh Đắk Lắk. Xử lí dược liệu: Thân vàng đắng rửa sạch, thái thành lát mỏng, sấy khô ở 50oC, xay thành bột thô.
Chất chuẩn đối chiếu: Berberin clorid do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp, hàm lượng 99,72% C20H18NO4Cl, hiện trạng nước 0,23%, SKS: 0103168
Các phần mềm chuyên dụng
Modde (2002): Thiết kế mô hình thực nghiệm.
FormRules v3.3 (2007) – Intelligensys:
Nghiên cứu nhân quả.
INForm v3.7 (2008) – Intelligensys: Tối ưu hóa quy trình.
Chiết xuất
Cân bột dược liệu. Lắp lưới và lót bông vào bình chiết. Cho bột dược liệu vào bình chiết.
Thêm dung môi chiết ngập mặt dược liệu, khuấy đều, ngâm trong thời gian thích hợp.
Cứ 1 giờ khuấy lại một lần. Rút dịch chiết.
Tiến hành chiết tương tự để thu được dịch chiết lần n. Thêm acid hydrocloric loãng đến pH=3 trước khi thêm NaCl. Khuấy mạnh cho tan hết natri clorid rồi để 24 giờ cho berberin kết tủa. Gạn lấy phần tủa. Lọc và rửa tủa bằng
dung dịch acid hydrocloric 0,4% để loại tạp chất. Sau đó rửa tủa bằng nước cho hết phản ứng acid. Thu được berberin clorid thô [2].
Định lượng:
Nguyên tắc: Theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Phụ lục 5.3 - Dược điển Việt Nam IV)
Tiến hành:
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 25,0 mg berberin clorid chuẩn (mc), hòa tan hoàn toàn vào bình định mức 250 ml trong pha động thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml (Cc).
Dung dịch thử:
Mẫu thử là berberin clorid thô hoặc berberin clorid tinh chế: Cân chính xác một lượng mẫu (mt) tương đương với 25 mg berberin clorid cho vào bình định mức 250 ml. Thêm 150 ml pha động, lắc cho đến khi tan hết, bổ sung pha động đến vạch thu được dung dịch có nồng độ C1. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 20 ml dịch lọc đầu thu được dung dịch thử.
Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế berberin clorid từ dược liệu vàng đắng bằng nước vôi
Mẫu thử là bột dược liệu: Cân chính xác khoảng 100 mg (mt) bột dược liệu (qua rây 710) vào bình định mức 100 ml, thêm 80 ml pha động, lắc siêu âm trong 40 phút, để nguội, thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử.
Pha động: Hòa tan 1,0 gam natri laurylsulfat trong hỗn hợp acetonitril - acid phosphoric 0,1% (1 : 1) và pha loãng thành 1000 ml với cùng dung môi.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (15 cm × 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 ( 3 µm)
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 345 nm, nhiệt độ cột: 30oC, tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Thể tích tiêm: 5 µl
Cách tiến hành: Lần lượt tiêm 5 µl dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN Xác định hàm lượng berberin trong dược liệu vàng đắng
Xác định hàm lượng berberin trong thân cây vàng đắng để đánh giá chất lượng nguyên liệu và tính được hiệu suất của quá trình chiết.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Bảng 1. Hàm lượng berberin trong dược liệu nghiên cứu
STT Hàm lượng berberin (C20H18NO4) (%)
1 2,46
2 2,52
3 2,49
TB 2,49 ± 0,035
Hàm lượng berberin trung bình của nguyên liệu đem khảo sát là 2,49% ± 0,035% như vậy dược liệu đem khảo sát đạt tiêu chuẩn chất lượng theo DĐVN IV (Hàm lượng berberin (C20H18NO4) không ít hơn 1,5% tính theo dược liệu khô kiệt).
Hình 1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn berberin clorid
Hình 2. Sắc ký đồ HPLC mẫu dược liệu Thiết kế mô hình chiết xuất
Quy trình chiết xuất berberin được thiết kế bởi phần mềm Modde gồm 32 thí nghiệm, berberin clorid tương ứng với các thí nghiệm theo thiết kế được kiểm nghiệm và kết quả được tóm tắt trong bảng 2. Ba thông số đầu vào quan trọng của quá trình chiết xuất cần nghiên cứu gồm:
thời gian chiết (X1), tỷ lệ dược liệu – dung môi (X2), nồng độ nước vôi (X3), được mã hóa thành các biến (X’1), (X’2), (X’3). Các thí nghiệm được thiết kế theo trực tâm quay.
PHÂN TÍCH LIÊN QUAN NHÂN QUẢ Dữ liệu trong Bảng 2 được dùng làm yếu tố đầu vào cho phần mềm thông minh FormRules.
Bảng 3. Xu hướng và mức độ liên quan nhân quả X1 X2 X3 R2 luyện
Y1 + + + 100
Y2 + + + 100
Bảng 2. Dữ liệu thực nghiệm quy trình chiết xuất berberin từ vàng đắng bằng nước vôi
STT
Thời gian chiết (X’1)
Dược liệu-dung môi (X’2)
Nồng độ nước vôi (X’3)
Thời gian chiết (X1)
Dược liệu-dung
môi (X2)
Nồng độ nước vôi
(X3)
Khối lượng berberin
(Y1)
Hàm lượng berberin
(Y2)
1 -1 1/5 -1 4 1/5 1 1,14 83,7
2 1 1/5 -1 24 1/5 1 1,92 84,9
3 -1 1/5 1 4 1/5 10 1,55 87,1
4 1 1/5 1 24 1/5 10 2,41 85,2
5 0 1/5 0 14 1/5 5,5 1,61 85,7
6 -1 1/6 -1 4 1/6 1 1,9 83,2
7 1 1/6 -1 24 1/6 1 1,98 83,5
8 -1 1/6 1 4 1/6 10 1,56 87,6
9 1 1/6 1 24 1/6 10 2,47 85,3
10 -1 1/7 -1 4 1/7 1 1,19 84,3
11 1 1/7 -1 24 1/7 1 1,93 83,5
12 -1 1/7 1 4 1/7 10 1,57 86,9
13 1 1/7 1 24 1/7 10 2,49 85,8
14 -1 1/7 0 4 1/7 5,5 1,57 86,7
15 1 1/7 0 24 1/7 5,5 2,18 85,1
16 0 1/7 -1 14 1/7 1 1,62 84,6
17 0 1/7 1 14 1/7 10 2,09 87,1
18 -1 1/8 -1 4 1/8 1 1,24 84,7
19 1 1/8 -1 24 1/8 1 1,97 85,1
20 -1 1/8 1 4 1/8 10 1,59 86,7
21 1 1/8 1 24 1/8 10 2,51 85,6
22 -1 1/9 -1 4 1/9 1 1,29 84,4
23 1 1/9 -1 24 1/9 1 1,98 84,6
24 -1 1/9 1 4 1/9 10 1,59 86,9
25 1 1/9 1 24 1/9 10 2,56 85,2
26 -1 1/10 -1 4 1/10 1 1,3 83,6
27 1 1/10 -1 24 1/10 1 2,01 84,3
28 -1 1/10 1 4 1/10 10 1,58 86,7
29 1 1/10 1 24 1/10 10 2,59 85,6
30 0 1/10 0 14 1/10 5,5 2,08 86,7
31 0 1/10 0 14 1/10 5,5 2,13 86,6
32 0 1/10 0 14 1/10 5,5 2,11 86,9
Ghi chú: X1: Thời gian chiết (giờ), X2: Tỷ lệ dược liệu/dung môi, X3: Nồng độ nước vôi (%m/v) Y1: Khối lượng berberin clorid thô (gam), Y2: Hàm lượng berberin clorid (%) Các biến mã hóa ( X’1) , (X’2), (X’3),0i = mức gốc, i = khoảng biến thiên
Khối lượng và hàm lượng berberin clorid có liên quan trực tiếp với tất cả 3 yếu tố khảo sát là thời gian chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi và nồng độ nước vôi. Trong đó yếu tố thời gian ảnh hưởng lớn tới hai biến đầu ra, yếu tố tỷ lệ dược liệu - dung môi ít ảnh hưởng.
i i (thùc) i ho¸) (m·
i
0 X x
λ
Hình 3. Minh họa mối liên quan giữa khối lượng berberin với thời gian chiết và nồng độ nước vôi Nhận xét: Thời gian chiết càng dài, nồng độ nước vôi càng cao thì khối lượng berberin clorid thô thu được càng nhiều
Hình 4. Minh họa mối liên quan giữa hàm lượng berberin với thời gian chiết và nồng độ nước vôi Nhận xét: Thời gian chiết dài hàm lượng berberin không tăng thêm, quá trình chiết xuất đạt tới cân bằng sau 12 giờ chiết.
Hình 5. Minh họa mối liên quan giữa khối lượng và hàm lượng berberin với thời gian chiết Nhận xét: Thời gian chiết càng dài tạp chất
càng khuếch tán, hòa tan vào dịch chiết nhiều hơn vì vậy khối lượng sản phẩm thô tăng trong khi hàm lượng hoạt chất chính là berberin không tăng thêm.
Tối ưu hóa thông số quy trình
Bảng 4. Xu hướng và mức độ liên quan nhân quả
Giá trị R2 Y1 Y2
Nhóm luyện 98,2% 96,6%
Nhóm thử 95,0% 87,7%
Dữ liệu trong Bảng 2 được dùng làm đầu vào cho phần mềm INForm v3.7 (2008). Với nhóm thử gồm 2 mẫu 14 và 16 và thuật toán RPROP, các mô hình liên quan nhân quả được thiết lập và đánh giá về mặt thống kê theo Bảng 4.
Mô hình Y1 có tính tương thích tốt (R2 = 98,2%) và khả năng dự đoán chính xác (R2 = 95,0%). Mô hình Y2 có tính tương thích tốt (R2 = 96,6%) và khả năng dự đoán chính xác (R2 = 87,7%). Cả hai mô hình đều có thể áp dụng trong giai đoạn tối ưu hóa thông số.
Điều kiện tối ưu hóa
X1: Thời gian chiết = số dương
X2: Tỷ lệ dược liệu/dung môi = số nguyên dương.
X3: Nồng độ nước vôi = số dương.
Y1: Hiệu suất = max = Up.
Y2: Hàm lượng berberin = max = Up.
Thông số tối ưu
X1: Thời gian chiết = 11,6 giờ, X2: Tỷ lệ dược liệu/dung môi = 1/8, X3: Nồng độ nước vôi = 4,2%.
Tính chất dự đoán
Y1: Khối lượng = 2,43 gam, Y2: Hàm lượng berberin = 87,2%.
Kiểm chứng thực nghiệm
Dược liệu vàng đắng được chiết xuất hai lần với cùng điều kiện và quy trình. Sản phẩm được xác định khối lượng và hàm lượng berberin, các giá trị kiểm nghiệm được so sánh với giá trị dự đoán cho bởi phần mềm INForm (Bảng 5).
Bảng 5. Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán Tính chất
sản phẩm
Thực nghiệm Dự đoán Lần 1 Lần 2 TB
Khối lượng (gam) 2,43 2,41 2,42 2,43 Hàm lượng
berberin (%) 86,8 87,2 87,0 87,2
Kết quả phân tích phương sai hai yếu tố không lặp đối với dữ liệu thực nghiệm: Quy trình có tính lặp lại (p < 0,05) và các giá trị dự đoán bởi phần mềm INForm so với giá trị thực nghiệm (trung bình) có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
KẾT LUẬN
Kết quả tối ưu hóa cho bởi phần mềm INForm: Thời gian chiết 11,6 giờ; tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/8 và nồng độ nước vôi 4,2%.
Việc áp dụng phương pháp truyền thống với sự hỗ trợ của phần mềm thông minh trong
quy trình chiết xuất giúp giảm chi phí, công sức và rút ngắn thời gian nghiên cứu. Đặc biệt đã hoàn thiện quy trình định lượng berberin trong vàng đắng bằng phương pháp HPLC giúp nâng cao chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Văn Giáp (2002), Thiết kế và tối ưu hóa công thức và quy trình, Nxb Y học, TP. HCM, tr.
1-97.
2. Đồng Quang Huy (2014), Nghiên cứu chiết xuất berbein từ vàng đắng bằng dung dịch kiềm, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Nguyễn Liêm (1980), “Chiết xuất Berberin bằng áp lực nóng”, Tạp chí Dược học, số (3), tr. 10.
4. Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm (2000), “Góp phần về nghiên cứu thực vật và hóa học của cây vàng đắng”, Tạp chí Dược liệu, tập 5, số (5), tr. 131.
5. Hồ Đắc Trinh (1983), “Chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch acid sulfuric loãng”, Tạp chí Dược học, số 3, tr.19.
6. Kulkarni S. K. (2008), “On the mechanism of antidepressant-like action of berberin clorid”, European Journal of Pharmacology, 589, pp.163-172.
7. Patil J. B. et al (2010), “Berberine induces apoptosis in breast cancer cells (MCF-7) through mitochondrial-dependent pathway”, European Journal of Pharmacology, 645, pp. 70-77.
SUMMARY
OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION BERBERIN FOR COSCINIUM FENESTRATUM COLEBR
Dong Quang Huy1*, Nguyen Quoc Thinh1, Le Thu Hoai2
1
TNU - University of mMedical and Pharmacy, 2Thai Nguyen College of Medical
Objective: Development and optimization of the extraction procedure for Coscinium fenestratum Colebr. at laboratory
Methods: Intelligent softwares were applied in the extraction procedure. This process was developed through steps: experimental design using Modde software, cause-effect study using FormRules software and optimization using INForm intelligent software and experimental observation.
Results: Data analysis showed that the amount and concentration of berberin were affected by three factors including calci hydroxyd concentration, material-solvent ratio and extraction times.
Conclusions: The optimized extraction parameters were determined as calci hydroxyd concentration (4.2%), material- solvent ratio 1/8 and extraction times (11.6 hours).
Keywords: extraction, berberine,Coscinium fenestratum Colebr. , Modde, FormRules, INForm Ngày nhận bài: 13/11/2017; Ngày phản biện: 07/12/2017; Ngày duyệt đăng: 30/01/2018
*Email: HuyDongQuangh@gmail.com
