• Không có kết quả nào được tìm thấy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DEXAMETHASONE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG HAI LẦN KHỐI PHỔ

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Chia sẻ "NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DEXAMETHASONE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG HAI LẦN KHỐI PHỔ "

Copied!
5
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Văn bản

(1)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DEXAMETHASONE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG HAI LẦN KHỐI PHỔ

Nguyễn Kiều Hưng1, Nguyễn Thanh Hải2

1Cục Cảnh sát phòng, chống tội phạm về môi trường - Bộ Công an

2Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên

TÓM TẮT

Bài báo này giới thiệu phương pháp xác định dexamethasone sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh. Mẫu được chiết bằng dung môi MeOH:H2O (9:1), pha động sử dụng nước và acetonitril (80:20), khoảng tuyến tính của dexamethasone dao động trong khoảng 0,5 - 5,0 mg/kg, hệ số tương quan R2 > 0,99, hiệu suất thu hồi dao động trong khoảng 73,33% - 103,4% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 2,56 - 4,22% tương ứng. Khẳng định chất nghiên cứu bằng 4 ion đặc trưng, đáp ứng yêu cầu của quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu. Phương pháp phù hợp cho việc xác định và định lượng dexamethasone trong thực phẩm chức năng.

Từ khóa: Dexamethasone; Glucocorticoid; UPLC/MS/MS; thực phẩm chức năng; Y tế.

ĐẶT VẤN ĐỀ*

Dexamethasone là một loại thuốc nhóm glucocorticoid được sử dụng trong ngành y tế với tác dụng chống viêm dị ứng, điều trị bệnh.

Bên cạnh đó, dexamethasone có khá nhiều phản ứng có hại, một trong những tác dụng phụ của nó là giữ muối, giữ nước, làm cho da đỏ hồng gây cảm giác béo giả tạo đối với người sử dụng. Lợi dụng tác dụng này, một số thầy lang hoặc nhà sản xuất đã cho thuốc này vào các thang thuốc hoặc thực phẩm chức năng để đánh lừa người dùng là thuốc làm béo, ăn ngon, tăng cân. Việc cho thuốc dexamethasone vào sản phẩm dùng cho trẻ em càng nguy hiểm gấp bội vì thuốc sẽ gây ra những tác hại khó lường đối với sự phát triển của trẻ, thậm chí tử vong. Ngoài tác dụng không mong muốn là gây rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng cân, dexamethasone còn có một loạt các nguy cơ khác như cao huyết áp, loãng xương, can xi không hấp thu vào xương, dễ gãy xương,…nếu dùng liều cao có thể gây rối loạn tâm thần. Những người bệnh phải sử dụng nhiều dexamethasone cũng bị tăng nguy cơ nhiễm trùng vì nó làm giảm miễn dịch, giảm sức đề kháng của cơ thể.

Nghiên cứu phát hiện và định lượng dexamethasone đã và đang thu hút được nhiều

*Tel: 0904 271277, Email: hungnk@vnu.edu.vn

tác giả nghiên cứu, mỗi kỹ thuật mà các tác giả đưa ra khác nhau, trên nhiều đối tượng mẫu khác nhau [1], [2], [3]. Dexamethasone là chất cấm sử dụng trong thực phẩm, theo quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu [4], kết quả phân tích chỉ được chấp nhận khi thực hiện trên kỹ thuật LC/MS/MS. Ở Việt Nam, hiện tại chưa có công trình công bố nào nghiên cứu định lượng dexamethasone bằng kỹ thuật UPLC/MS/MS.

Bài báo này giới thiệu phương pháp phát hiện, định lượng dexamethasone trong một số thực phẩm chức năng sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh. Mẫu được chiết bằng hỗn hợp dung dịch MeOH:H2O (9:1), không cần làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn, định lượng trên UPLC/MS/MS. Khẳng định chất nghiên cứu bằng 2 ion đặc trưng, phương pháp được thẩm định theo quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hoá chất

Acetonitril (ACN), metanol (MeOH), loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); Nước tinh khiết dùng cho HPLC (Merck, Đức); Chuẩn dexamethasone 99,6% (Viện kiểm nghiệm

(2)

thuốc Trung ương); Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 mg/l được pha trong MeOH, bảo quản -20o C, sử dụng trong 3 tháng. Dung dịch chuẩn làm việc được pha từ chuẩn gốc hỗn hợp tại các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 5,0 mg/l bằng MeOH, pha trước khi sử dụng.

Pha động A là ACN, pha động B là nước.

Thiết bị

Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ UPLC-MS/MS (Waters, Mỹ), gồm các bộ phận chính như bơm, bộ tiêm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cột, bộ khử khí, bộ ghép nối khối phổ Waters Acquity TQ Detector và phần mềm xử lý Masslynx 4.1. Cột sắc ký Acquity UPLC(R)BEH C18 2.1x100 mm, 1,7 µm, (Waters, Mỹ). Chương trình pha động bắt đầu 20% A, giữ trong 2 phút, tăng lên 80% A tại 2,5 phút và kết thúc tại điều kiện ban đầu, tổng thời gian chạy là 5 phút, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl. Nhiệt độ cột 30

oC. Chế độ phân tích đa kênh MRM, kiểu ion hóa dương, nhiệt độ nguồn 150 oC, nhiệt độ khử dung môi 400 oC, dòng khử khí 800L/Hr.

Điện thế mao quản 4,0 kV, điện thế cone 39V, áp suất chân không 3,60.e-3 mbar. Thời gian lưu của dexamethasone là 3,64 phút (hình 1). Năng lượng phân mảnh các ion đặc trưng được trình bày trong bảng 1.

Hình 1. Sắc ký đồ ion định lượng và ion xác nhận của dexamethasone trong dung dịch chuẩn nồng

độ 0,5mg/l Quy trình xử lý mẫu

Cân chính xác 2,0 g phần mẫu thử đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm 50 ml. Thêm chính xác 10 ml MeOH:H2O (9:1), vortex 10 phút cho đều mẫu, giữ trong bể siêu âm đúng 30 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút (to phòng), sau đó gạn lấy phần dịch trong.

Tiếp tục chiết lặp lại lần nữa, gộp toàn bộ dịch chiết, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, gạn lấy phần dịch trong, định mức chính xác đến 20 ml bằng dung môi pha động, hút 1ml lọc qua màng lọc 0,22 µm, khử khí và tiến hành đo trên máy UPLC/MS/MS.

Bảng 1. Năng lượng phân mảnh của Dexamethasone Tên chất Ion sơ cấp

(m/z)

Ion thứ cấp (m/z)

Thời gian Dwell (s)

Điện thế Cone (V)

Năng lượng Cone (eV)

Dexamethasone 393,16 237,05 0,16 38 22

355,07a 0,16 38 14

(a)ion định lượng

Collision Energy / eV

%

0 100

2.0 17.6 33.2 48.8 64.4 80.0

1.608e+006 m/z 393.16 -> 355.07

14

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100 2.046e+005

Hình 2. Collision Energy Optimization (m/z 393,16 -> 355,07)

(3)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc

Kỹ thuật LC/MS/MS luôn có tính đặc hiệu cao, sự có mặt của chất phân tích đều được khẳng định chắc chắn thông qua ion phân tử và hai ion sản phẩm. Theo quyết định 657/2002/EC của Châu Âu, tính đặc hiệu được đánh giá thông qua số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion xác nhận và định lượng, số điểm IP cần phải đạt là 4 điểm, trong đó mỗi ion mẹ được tính là 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm. Tỷ lệ ion trên mẫu thử so với tỷ lệ ion trên chuẩn cũng đã được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu phương pháp, kết quả bảng 1, bảng 2 cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu tốt, đáp ứng các yêu cầu của Châu Âu.

Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích

Trong phân tích LC/MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hưởng rất lớn đến độ chính xác của kết quả phân tích, từ giai đoạn chuẩn bị mẫu đến giai đoạn định lượng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion). Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình phân tích là rất quan trọng. Kết quả bảng 2 cho thấy các diện tích píc của mỗi ion lần lượt trong dung dịch chuẩn và dung dịch thêm chuẩn vào nền mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều này chứng tỏ không có hiệu ứng nền trong giai đoạn tạo ion ở đầu dò khối phổ. Khoảng dao động ion của dexamethasone trong dung dịch mẫu đều nằm trong khoảng cho phép, phù hợp với quyết định 657/2002/EC của Châu Âu.

Bảng 2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu và cường độ dao động ion

Chất phân tích Nồng độ (mg/l) 1,0 2,0 5,0 Khoảng dao động ion (%) Dexamethasone

Dung dịch chuẩn A355 A237

2145 1037

4962 2441

13642

6780 0,47 - 0,50 Thêm vào mẫu sau xử lý A355

A237

2403 1203

4863 2375

15428

7640 0,48 - 0,50 Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Đường chuẩn được thực hiện trên nền mẫu trắng thêm chuẩn (phương pháp thêm chuẩn) tại các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 5,0 mg/kg. Kết quả cho thấy đường chuẩn dexamethasone tuyến tính trong khoảng từ 0,5 - 5,0 mg/kg, R2 > 0,99, độ thu hồi ở các điểm chuẩn đều thỏa mãn yêu cầu (

≤ 10%).

Hình 3. Đường chuẩn định lượng dexamethasone Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi

Độ thu hồi được đánh giá dựa vào mẫu thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ là thấp (0,7 mg/kg); trung bình (1,0 mg/kg) và cao (2,0 mg/kg). Sử dụng đường chuẩn để tính toán. Tại mỗi nồng độ, thực hiện chiết độc lập, mỗi nồng độ phân tích 3 lần, trong 3 ngày khác nhau. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi dexamethasone khá cao, dao động trong khoảng 73,33% đến 103,4% (RSD% dao động trong khoảng 2,56 đến 4,22) đáp ứng được yêu cầu của Quyết định 2002/657/EC.

(4)

Bảng 3. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi

Nồng độ mẫu (mg/kg) Dexamethasone

HTB (%) RSD% (n = 6)

0,5 73,70 4,22

1,0 82,42 2,56

2,0 89,11 2,32

Hình 4a. Sắc đồ mẫu thực phát hiện dexamethasone

Hình 4b. Sắc đồ mẫu thực không phát hiện dexamethasone KẾT LUẬN

Đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng phương pháp xác định dexamethasone trong một số dạng thực phẩm chức năng sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC/MS/MS đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh.

Phương pháp đã được thẩm định theo quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu. Phương pháp đã được áp dụng phân tích 20 mẫu thực tế trên khu vực miền Bắc Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Garcia C. V., Breier A. R., Steppe M., Schapoval E. E. S., Oppe T. P. (2003),

“Determination of dexamethasone acetate in

cream by HPLC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (31), pp. 597-600.

2. Christianson C. D., Laine D. F., Zimmer J.

S., Johnson C. J., Sheaff C. N., Carpenter A., Needham S. R. (2010), “Development and validation of an HPLC-MS/MS method for the analysis of dexamethasone from pig synovial fluid using dried matrix spotting”, Bioanalysis, Vol. 2, No. 11, pp. 1829-1837.

3. Yuan Y., Zhou X., Li J., Ye S., Ji X., Li L., Zhou T., Lu W. (2015), “Development and validation of a highly sensitive LC-MS/MS method for the determination of dexamethasone in nude mice plasma and its application to a pharmacokinetic study”, Biomed Chromatogr, (4), pp. 578-83.

4. Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results.

(5)

SUMMARY

A SIMPLE METHOD OF DERTERMINATION OF DEXAMETHASONE IN FUNCTIONAL FOODS USING ULTRA PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY

Nguyen Kieu Hung1*, Nguyen Thanh Hai2

1Environment Police Department - Ministry of Public Security,

2University of Agriculture and Forestry - TNU

A method based on ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC/MS/MS) as development for simply and rapid determination of the residues of dexamethasone in functional foods. The sample was extracted by MeOH: H2O (9:1) and then analyzed in multiple reaction monitoring (MRM) mode. Mobile phase was ultrapure water and acetonitrile (80:20). Under the optimized detection conditions, the linear range for dexamethasone is 0.5 - 5.0 mg/L, the linear correlation coefficients are more than 0.99. The recoveries of dexamethasone range from 73.33% - 103.4% with relative standard deviations (RSD) of 2.56 - 4.22%. This method is simply, effective, sensitive, which is suitable for the determination and confirmation of dexamethasone in functional foods.

Keyword: Dexamethasone; Glucocorticoid; UPLC/MS/MS; functional food; Functional foods;

Medical.

Ngày nhận bài:17/4/2017; Ngày phản biện:04/5/2017; Ngày duyệt đăng: 31/7/2017

*Tel: 0904 271277, Email: hungnk@vnu.edu.vn

Tài liệu tham khảo

Tài liệu liên quan

Mặc dù trong nghiên cứu này chúng tôi chƣa xác định đƣợc liệu kiểm soát tốt glucose máu có giải quyết đƣợc hết tình trạng PĐCT và RLCN tim ở thai nhi có mẹ

Một số khu vực có điều kiện tốt để xây dựng tổ hợp điện gió - điện mặt trời nối lưới chủ yếu là các các địa phương ven bờ Nam Trung Bộ (từ Tuy Hòa trở vào) và Nam Bộ,

Do đó, trên cơ sở am hiểu chức năng của máy tính và vận dụng kiến thức toán học, chúng tôi trình bày một số ứng dụng chuyên sâu của chức năng bảng tính các giá trị

Các phân tích cho thấy để chế tạo bê tông UHPC cần sử dụng máy trộn cưỡng bức tăng cường (intensive), để đảm bảo tính đồng nhất cao của hỗn hợp bê tông với tỷ lệ

Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ trồng và liều lượng đạm bón đã ảnh hưởng đến chiều cao cây, số cành cấp 1, sâu bệnh, các yếu tố cấu thành năng suất và năng

Nhóm nghiên cứu đã sử dụng đèn LED ánh sáng xanh, ánh sáng trắng từ nguồn năng lượng mặt trời để chế tạo thiết bị bắt côn trùng gây hại giúp bảo vệ con

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng phương pháp định tính, định lượng dexamethason acetat trong một số chế phẩm đông dược có tác dụng hỗ trợ

Do đó, cần xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong lá chùm ngây bằng quang phổ UV-VIS nhằm kiểm soát chất lượng của