TAP CHỈ k h o a h ọ c D H Q G H N , KHTN & CN, T.xx, sỏ' 4, 2004
THIẾT KẾ CẶP MỒI ĐẺ NHÂN ĐOẠN GEN 18S ARNR CỦA HAI LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA CRASSIPHYLLA VÀ CAMELLIA
TAMDAOENSIS ở VƯỜN QUOC GIA TAM ĐAO
N g u y ề n V ăn Mùi, N g u y ề n T rọn g B ình
K h o a S i n h h ọ c, T rư ờ n g Đ ạ i học K h o a học T ự n h iê n , Đ H Q G H N
1. Mở đầu
Cây tr à là tê n gọi c h u n g cho các loài thuộc chi C am ellia (Camellia), họ chè (Theacea), bộ chè (T heales), p h â n lớp sổ (.D illen iid ea), lớp h ai lá m ầm (D iotyedoneae), n g à n h thực v ậ t h ạ t kín tA n g io sp erm a e) [1]. Chi C am ellia có th â n gỗ h a y bụi, lá đơn mọc cách, mép k hía rộng nông và đều, p h iế n lá, cứng m à u đậm , bóng, không có lá kèm, chồi non do lá mọc úp lên n h a u ở nách lá h a y đ ầ u cành, dai, m à u n h ạ t, dễ n h ậ n . Hoa to, mọc đơn độc ở nách lá, gốc có h ai hay n h iề u lá bắc.
Theo th ố n g kê n ă m 1991, tro n g cuôn "Cây cỏ Việt N am " của P h ạ m Hộ đã giỏi th iệ u 30 loài dưới tên chi C a m ellia. N ă m 1994, dựa trê n công tr ì n h ng h iê n cứu của tác giả người P háp cùng với n g h iê n cứu của tác giả N guyền H ữu Hiến đã th ô n g kê t ấ t cả các họ chè ở Việt N am tro n g đó chi C a m ellia có 37 loài.
Cho đến n a y t r ê n th ê giới cũ ng n h ư nước ta, việc p h â n loại chủ yếu dựa vào các đậc điểm h ìn h thái, cấu tạ o giải p h ẫ u bên trong. Với sự p h á t triể n của sin h học p h â n tử và công nghệ gen đà x u ấ t h iệ n m ột sô n g à n h kho a học mới: p h â n loại học p h â n tử- chủ yếu dựa trê n các kỹ t h u ậ t p h â n tích ADN ... là n h ữ n g công cụ hỗ trợ đắc lực cho các n h à p h â n loại học trong việc p h á t h iệ n loài mới, giải quyết các môi nghi ngờ về vị tr í p h â n Joại đ á n h giá đầy đủ vê tín h đa d ạ n g di tru y ề n , q u a n hệ c h ủ n g loại tiến hoá của n h iề u loài động vật, thực v ật và vi sinh vặt. Các công tr ì n h ng h iê n cứu ứng d ụ n g kỹ t h u ậ t p h â n loại p h â n tử đã và đang góp p h ầ n đ á n h giá tín h đa d ạ n g sin h học, đ ịn h hướng kho a học cho việc báo tồn và khai thác hợp lý nguồn tà i ng u y ê n động vật, thực v ậ t trê n th ê giới cũ ng n h ư ở nước ta , tron g đó đã có m ột sô" n g h iê n cứu về phương p h á p RAPD-PCR và th iế t kê m ột s ố mới đê p h â n tích trìn h tự ADN cho p h â n loại t r à [4,5].
Một số loài t r à tro n g chi C am ellia có giá trị k in h t ế cao [6]. Đặc b iệ t g ần đây do yêu cầu ngày càng cao về ngh ệ t h u ậ t cây c ả n h một sô" loài tro n g chi C a m ellia đ a n g là đôi tượng bị khai thác. Do đó, cây t r à là m ột tro n g n h ữ n g nguồn tà i n gu yên cần được bảo vệ, p h â n loại đê đưa r a các biện p h á p thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, tín h đa d ạ n g sin h học, cách nuôi tro n g nhà và n h â n giống chi C am ellia.
82
Thiel kẽ cặp mối dê nhím đoạn gcn. 83
2. N g u y ê n liệu v à p h ư ơ n g pháp n g h iê n cứu
2.1. N g u y e n liệ u
T ro n g n ghiên cứu n à y c h ú n g tôi sử d ụng hai m ẫu t r à là:
- C am ellia c ria ssip h yllia N in h et H ak id a - C a m ellia tarndaensis
Các m ẫ u n à y được lấy từ vườn Quốc gia Tam Đảo do TS. T r ầ n N in h c u n g cấp.
2.2. P h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
T h à n h tê bào thực v ậ t bị p há võ b ằn g biện p h á p cơ học k ế t hợp với sủ d ụ n g các chất tầy rử a m ạ n h , ADN được giải phóng và làm sạch tạ p c h ấ t nhờ p ro te in a se K, d u n g dịch C H C Ịr isoA (24:1). ADN được k ế t tủ a tro n g cồn tu y ệ t đối ở 2 0°c và t h u được k ế t tủ a tu y ệ t đôi ()' 20°c v à th u được nhờ ly tâ m cao tốc. AND được tá ch chiết theo phương p h á p của Roger J và cộng sự [8].
- N guyên tắ c của p h ả n ứng PCR là sử d ụ ng enzym ADN po ly m e ra se chịu n h iệ t đế tổng hợp tro n g ống n gh iệm các đoạn ADN mới từ m ạch k hu ô n tro n g môi trư ờ n g dư th ừ a các
dN T P và cặp mồi đặc h iệu [7].
P h ả n ứng PC R được thực hiện n h ư sau: 25j.ll đệm 10X; Sf.ll MgSOị lOmM; 2,5j.il dN TP nồng độ 2,5 mM mồi loại; 2f.ll p rim e r mỗi loại và 2\i\ Taq ADN polym erase. C h u trìn h nhiệt hao gồm 90°C: 30", (95° C: 1\ 52° C: r3 0 " ; 72° C: 1’30"), lặp lại 35 chu kỳ; 72°C:10; giữ ỏ 4°c.
Sản p h ẩ m PCR được kiếm tr a b ằ n g điện di trê n gel agarose 1%.
3. K ế t q u ả v à t h ả o l u ậ n
3.1. T á c h c h iế t và tin h c h ế a d n tô n g s ô 'từ lá trà
Việc tách chiết và tin h c h ế ADN được c h ú n g tôi thực hiện tr ê n h a i loài t r à là C a m ellia c ra ssip h ylla N in h et H ako da và C am ellia tam daonensis.
Mọi n g hiên cứu tr ê n to à n bộ gen đều được b ắ t đ ầ u từ việc tá c h ch iết được ADN tổng sô ở d ạ n g tin h sạch và k hô n g bị đ ứ t h a y p h â n huỷ bởi các tác n h â n cơ học h a y hoá học. Hiện nav, có r ấ t nhiều phương p h á p tách chiết ADN thực vật, mỗi phương p h á p có n h ữ n g ưu điểm p h ù hợp cho từ n g đôi tượng. Vì vậy, việc lựa chọn phương p h á p th íc h hợp cho đối tượng n g h iê n cứu của m ìn h là r ấ t q u a n trọng. Do mô lá t r à có n h iê u p ro te in và sắc tổ’, nên c hú ng tôi đ ã sử d ụ n g p ro te in a se K, SDS và PV P để tiế n h à n h tá c h chiết ADN tổng sô".
S a u khi tiến h à n h loại ARN, c h ú n g tôi kiểm t r a độ sạch của s ả n p h ẩ m ADN trê n gel ag aro se 1%. Kết q u ả điện di được th ể h iệ n tro n g h ìn h 1:
Tạp chí Khoa học DHQGHN. K IỈT N & CN. T.xx. S ố 4, 2004
X4 Nguyen Vãn M ù i. Neuyẻn Trọng Bình
--- — — --- ---— ' -
Kp M 1 2 3 4 Kp
21.1 21
H ì n h 1: AON tổ n g sô trư ớ c và s a u loại ARN M: M a r k e r - T h a n g c h u ẩ n (AD N c ắ t b ằ n g Eco RI)
G iế n g 1: A D N tổ n g s ố c ủ a loài C a m e llia c ra s s ip h y lla c h ư a lo ại bỏ ARN G iế n g 2: A D N tố n g sô' c ủ a loài C a m e llia c r a s s ip h y lla c h ư a loại bỏ ARN G iế n g 3: A D N tố n g s ố c ủ a loài C a m e llia c r a s s ip h y lla loại A R N
Giếng 4: ADN tổng số của loài Camellia tamdaonensis loại ARN
Kết quả trê n h ìn h 1 cho th ấ y ở giếng 1, 2, 3, 4 đều x u ấ t hiệ n 1 b ă n g ADN tương ứng với bảng có kích thước 21,1Kb của b ă n g ADN c hu ẩn. N h ư vậy, ch ú n g tôi n h ậ n được ADN tổng số của 2 m ẫ u t r à tro n g chi C am ellia.
Ớ giếng 3 và giếng 4, ADN tổng số tá ch chiết kh ông bị đ ứ t gãy và ARN đã bị loại bỏ hoàn toàn, có th ê đ ả m bảo yêu cầu c h ấ t lượng cho p h ả n ứ n g PCR. Còn ở giếng 1 và giếng 2, ngoài ADN tổng số v ẫ n còn ARN chưa bị loại bỏ và ARN tạo v ệ t s á n g cuối cùng ỏ b ả n gen.
3.2. N h ả n đ o ạ n tr ìn h tự c ủ a g e n 18S A R N r b ằ n g k ỹ th u ậ t P C R
Ớ các loài thực v ậ t nói chung, đoạn gen 18S A R Nr được các n h à khoa học đ á n h giá là vùng có ý ng hía ổn định về m ặ t tiế n hóa. Do vậy, tr ì n h tự nucleotide trê n vùng này thường được sử d ụ n g để xác định môi q u a n hệ tiế n hóa và p h á t sin h c h ủ n g loại giữa các loài. Vì vậy, tron g n gh iê n cứu này, ch ú n g tôi đã lựa chọn trìn h tự nucleotide t r ê n đoạn gen 18 A RNr đê nghiên cứu n h ằ m hướng tới n h ữ n g p h â n loại tr à tro n g chi C am ellia.
3.2.1. T h iết k ế và tồng hợp cặp m ồi đặc hiệu cho gen 18S A R N r của cây trà
Đê thực hiện được p h ả n ứ n g PC R cần p h ả i có đầy đủ các yếu t ó đoạn ADN k hu ôn (tem plate DNA), cặp mồi (primer), ADN polym erase, các loại đ N T P và dung dịch đệm thích hợp. Vì vậy, cùng vối việc tá c h ch iết ADN tống sô"chúng tôi đã tiế n h à n h th iế t kế cặp mồi đê n h ậ n được đoạn ADN của gen 18S ARNr.
Dựa trê n một số tr ì n h tự ở 2 đ ầ u đo ạn gen 18S A R N r của m ột sô loài thực v ậ t bậc cao đã được công bố, chúncĩ tôi đã th iế t kê cặp mồi có kích thước 2 1bp. Đ ây là vùng bảo t h ủ cao tro ng tiến hóa. Vì vậy, ch ú n g tôi dự đoán vùng bảo th ủ n ày c ũng có m ậ t tron g trìn h tự gen 18S A RNr của các loài tro n g chi C am ellia. Theo lý th u y ế t, sử d ụ n g cặp mồi này sẽ n h ậ n được đoạn gen 18S A R N r có kích thước k h o ả n g 1,7 Kb.
Tạp chi Khoa lìỌ C ĐHQGHN. K Ỉ Í Ì N & CN. 'I XX. Sô'4, 2004
Thiel kê cặp mồi tic nhàn đoạn í»cn. 85
Cặp mồi c h ú n g tôi th iế t kê được có kích thước và tr ìn h tự n h ư sau:
Mồi xuôi (ký h iệ u BVB): 3' - GCGATCCGAACACTTCACCGG-5' MỒI ngược (ký hiệu BVF): 5' - GCTTGTTCTCAAGTTAAGCC-3'
________________ P r im e r BVB ^
T C 18S NNNNGGTTG ATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCAAAGATTAAGCC ATGCA 55
MC18S GTCATATGCTTGTCAAAGATTA AGCCATGCA 33
T C 18S TGTGT A AGT ATG A ACTA ATTC AG ACTGTGAA ACTGCG A ATGGCTC ATT A A ATC AG 110 M C18S TGTGTA AGTATG AACTAATTCAG ACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTA AATCAG 88 T C 18S TTATAGTTTGTTTG ATGGTATCTGCTACTGG ATA ACCGTAGTA ATTCTAG AGCT 165 M C 18S TT ATAGTTTGTTTG ATGGTATCTGCTACTCGG ATA ACCGTAGTA ATTCT AG AGCT 143
TC 1 xs AAGCGCG AGTCATCC AGCTCGCNNTG ACTACGTCCCTGCCCTTTGTAC AC ACCGCC 1648 M C 1 xs A AGCGCG AGTCATCAGCTCNNNTTGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC ACCFCC 1627
T C 18S CGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCNGCGACGTGG 1703
M C1 xs CGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCGGCGACGTGG 1682
M P rim e r BVF
MC: M e n isp e rm u m canadense TC: T inospora c a ff ra
H ìn h 2: So s á n h tr ì n h tự n u c le o tit ở đo ạn đ ầ u v à đ o ạn cuổì c ủ a đ o ạ n gen 18S A R N r c ủ a 2 loài th u ộ c 2 chi tro n g họ Menispermacea đê t h iế t kê đ o ạn m ồi 18S A R N r.
3.2.2. N h à n đoạn A D N bằng kỹ th u ậ t PC R
C h ú n g tôi tiế n h à n h p h ả n ứng PCR đê n h â n đoạn gen 18S A R N r từ ADN tổng sô của 2 loài tro n g chi C a m ellia là C a m ellia crasiphyla và C a m illa ta m d a o n e n sis nhò sử d ụ ng cặp mồi đã được t h i ế t k ế và tổn g hợp và BVF và BVB.
P h ả n ứ n g n h â n đoạn gen 18S ARNr gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau:
- Giai đo ạn 1: giai đ o ạ n làm biến tính ADN - Giai đo ạn 2: giai đ oạn g ắ n mồi
N h iệ t độ g ắ n mồi p h ả i th ấ p hơn n h iệ t độ nóng chảy của các mồi đê cho các đoạn mồi gắn với n h a u th e o tr ì n h tự tương hợp trê n p h â n tử ADN là m khuôn. Đồng thời n h iệ t độ gắn mồi củ n g khô ng được q u á th ấ p k h iế n cho k h u ô n bị tiế n tín h , nó p h ụ thuộc vào từ n g loại mồi, cụ thê có th ể tín h to á n dựa tr ê n n h iệ t độ nóng cháy (Tm) của đ oạn mồi.
T uy n h iê n , để dễ d à n g tro n g việc tín h to án n h iệ t độ nóng ch áy củ a đoạn mồi, chúng tồi sử d ụ n g công th ứ c tín h đơn g iản của C haw s . M:
T m = 2°c X (A+T) + 4°c X (G+C) + 3,3°c
Tap chi Khoa học Đ HỌCi/ỈN. K H TN á CN, T.xx. Sổ4, 2004
Nguyen Văn Mùi. Nmiyển Trọnsi Bình
Trong đó:
- A: A denin - T: Timin - G: G u a n in - C: Cytosin - Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài chuỗi
S a u k h i t h ụ c hiện p h a n ưng PCR, chú ng tôi đã kiểm tr a sản p h ẩ m ADN trên gel agarose 1"«» và th u dược k ế t quá tron hình 3.
Kp M 1 2
M: (M a rk er): th a n g A D N c h u ẩ n G iến g 1: s ả n p h ẩ m P C R c ú a loài Camellia crasiphylla
G iến g 2: s ả n p h a m P C R của m ẫu Ca me 11 ia ta m daoneĩisis
1.7
H ì n h 3 Két q u ả đ iện di s ả n p h ẩ m PCR
Két quá phô diện di cho th ấ y ỏ cả hai loại tr à ch ún g tôi đểu th u được s ả n phâm PCR vào khoáng 1,7 kb. Đây la kích thước đặc trư n g cho gen mã hóa 18S A R N r có tín h bảo th ủ cao trong quá trìn h tiến hóa và p h á t sin h ch ún g loại nên phương p h á p p h â n loại phân tử có thê đánh giá sự khác n h a u giừa các loài dựa trê n n h ữ n g tr ì n h tự sắp xếp của các nucleotide trên gen IBS ARNr. Tuy nhiên, đê đ á n h giá sự khác biệt các đoạn trìn h tự 18S ARNr của các loài trong chi C a m illa đã được n h â n lên, cần nghiên cứu sâu hơn th ô ng q ua các phương pháp p h ản tích chọn dòng và giải trìn h tự nucleotide của các đoạn gen này.
4. K ế t l u ậ n
1. Tách chiết và tin h sạch được ADN tống sô" từ hai loại tr à tro n g chi C am ellia là C am ellia crassiphylla N in h et H akoda và C am ellia ta m d a o n en sis
2. T h iết kê được cặp mồi BVF và BVB đặc hiệu đê n h ả n đoạn gen m ã hóa 18S ARNr ở chi C am ellia
3. N h â n được đoạn gen mã hóa 18S rARN có kích thước 1.7kb của hai loài thuộc chi C am ellia bằng kỹ t h u ậ t PCR.
Tạp i hi Khoa lun DUQCHN, KHTN <í CN. T.xx. So 4. 2004
Thiel ke cặp mồi lie nhân đoạn gcn.
C ặp mồi c h ú n g tôi th iế t k ế dược có kích thước và tr ìn h tự n h ư sau:
MỒI xuôi (ký hiệu BVB): 3' - GCGATCCGAACACTTCACCGG-5' Mồi ngược (ký h iệu BVF): 5’ - GCTTGTTCTCAAGTTAAGCC-3'
________________ P r im e r BVB
TC 1 xs NNNNGGTTG ATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCAAAGATTAAGCCATGCA 55 MC18S GTC AT ATGCTT GTC AA AG ATT A AGCC AT GC A 33
TCI8S TGTCÌ TAAGTATGAACTAATTCAGACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAG 1 lơ
MC1 s s TGTGTAAGTATG AACTAATTCAGACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAA ATCAG 88 T C18S TTATAGT TTGTTTG ATGGTATCTGCTACTGG ATA ACCGTAGTA ATTCTAG AGCT 165 MC18S TTATAGTTTGTTTGATGGTATCTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCT 143
T C 1 s s A AGCGCG AGTCATCCAGCTCGCNNTGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCC 1648 VI c I s s AAGCGCGAGTCATCAGCTCNNNTTGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCFCC 1627 TC18S CGTCGCTCCTACCGATTGA ATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCNGCGACGTGG 1703 MC1SS CGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGTGTTCGGATCGCGGCGACGTGG 1682
* P rim e r BVF
MC: M e n isp e rm u m canadense TC: Tinospora ca ffrci
H ì n h 2: So s á n h t r ì n h tự n u c le o tit ở đo ạn đ ầ u v à đ o ạn cuôi c ủ a đ o ạ n g en 18S A R N r c ủ a 2 loài th u ộ c 2 chi tro n g họ Menispermacea để th iế t k ê đ o ạn mồi 18S A R N r.
3.2.2. N h â n đoạn A D N b ằ ng kỹ th u ậ t PC R
C h ú n g tôi tiế n h à n h p h ả n ứng PCR để n h â n đoạn gen 18S A R N r từ ADN tổng số của 2 loài tr o n g chi C am ellia là C am ellia crasiphyla và C am illa ta m d a o n e n sis nhờ sử dụng cặp mồi đã được th iế t kê và tông hợp và BVF và BVB.
P h á n ứng n h â n đoạn gen 18S ARNr gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính nh ư sau:
- G iai đoạn 1: giai đoạn là m biến tín h ADN - G ia i đoạn 2: giai đoạn gắn mồi
N h iệ t độ gắn mồi p h ả i th ấ p hơn n h iệ t độ nóng chảy của các mồi đê cho các đoạn mồi gắn với n h a u theo tr ì n h tự tươ ng hợp trê n p h â n tử ADN là m khuôn. Đồng thòi n h iệ t độ gắn mồi c ũ n g không được q u á th ấ p k h iế n cho k h u ô n bị tiế n tính, nó p h ụ thuộ c vào từ n g loại mồi, cụ t h ê có thê tín h to á n dựa tr ê n n h iệ t độ nóng c h áy (Tm) của đoạn mồi.
T u y nhiên, đê dễ d à n g tro n g việc tín h toán n h iệ t độ nóng cháy của đoạn mồi, chúng tôi sử d ụ n g công thức tín h đơn g iản của Chaw s . M:
Tm = 2°c X (A+T) + 4°c X (G+C) + 3,3°c
rạp chi Khoa hục ĐHQCỈ/iN. KH TN & CN, T.xx, Sổ4, 2004
<X6______________ Niiiiycn Vãn Mùi. Nizuycn Trọrìii Bình
Trong đó:
- A: A denin - T: Timin - G: G u a n in - C: Cytosin - Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài chuỗi
Sau klìi thục hiện phan Ill'll! PCR, chúng tôi dã kiểm tra san phẩm ADN trên %e\
iìSTiìi-osc ] va thu clùọc kôt qua t r r n hình 3.
Kp M 1 2
M: (M ark er): th a n g ADN c h u ẩ n G iến g 1: s a n p h ẩ m PCR c ủ a loài Cci me Ị l i « c ỉ 'ũ s i Ị) h V / / 0
G iên g 2: sả n p h â m PCR c ủ a m â u Ca m e ỉ l ị a ỉ cun d a oil (77 SIS
1.7
T1 i1111 .‘ỉ Két cỊuà diện di s à n p h à m PCR
Krt (ỊIIM phô itiện di cho thấy ó cá hai loại tr à chú ng tôi đều thu được san phárn PCR vào khoang 1,7 kb. Day la kích thiíỏr (lặc trư ng cho gen mã hóa 18S AKNr có tính báo thu cao trong quá trìn h tiên hóa và p h á t sinh chủng loại nên phương p háp phán loại p h â n tứ có thê đ ánh giá sự khác n h a u giừa các loài dựa trê n n h ữ n g trìn h tự săp xép của các nucleotide trên gen 18S ARNr. Tuy nhiên, đỏ đ á n h giá sự khác hiệt các* đoạn trìn h lự 1SS ARNr của các loài trong chi C a m llia đã dược n h â n lên. cần nghiên cứu sâu hờn thông qua các phương pháp p h â n tích chọn dòng và giải trìn h tự nucleotide của các đoạn £en này.
4. K ế t l u ậ n
1. Tách chiêt và tin h sạch dược ADN tống số từ hai loại trà trong chi C am ellia là C am ellia crassiphylla N inh et H akoda và C am ellia ta m d a o n en sis
2. T hiêt kê được cặp mồi BVF và BVB dặc hiệu đê n h â n đoạn gen mà hóa 18S ARNr ờ chi C am ellia
3. N h ân được đoạn gon Hìã hóa 18S rARN có kích thước l.Tkb c ư a hai loài thuộc chi C am ellia bang kỹ t h u ậ t PCR.
i l l Ị) i III Khi ti t lun D I I ( J ( i H \ . K i l l X ư c s . I XX. So-ỉ . 200-1
ĩhiốt kc cap mồi do nhân đoạn ucn. 87
TÀI L IỆ U THAM KHẢO
1. Võ Văn Chi và T rần Hợp, Cây cỏ có ích ở Việt N a m, NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999, 700tr 2. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt N a m , MeKong Printing Montrea, 1991, 430tr.
3. Nguyền Vcăn Mùi, Bùi Thị Mai Hương, Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số loài trà hoa trắ n g (C am ellia) ỏ vườn quốíc gia Tam Đảo bằng kỹ th u ậ t RAPD-PCR, N hững vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sông, Hội nghị khoa học toàn quốc 2004, NXB Khoa học và Kỹ th u ậ t, Hà Nội, 2004, tr. 529-532.
4. Trương Quốc Phong, Nguyễn Văn Mùi, Nhân đoạn ITSJ-AND,. 5,85-ITS.j bằng kỹ thu ật PCR để phân loại một sô' loài trà (Camellia), Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ th u ậ t, Hà Nội, 2003, tr. 1191-1194.
5. Trương Quốc Phong, Nguyễn Văn Mùi, Tách dòng 2 đoạn gen ITS,-5,85-ITS2 và microsatelline locus 37 dùng đê phân loại hai loài trà vàng Camellia cucphuongensis và Camellia Hava. N h ữ n g vấn để nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sông, Hội nghị khoa học toàn quốc 2004, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2004, tr. 192-195.
6. Nguyễn Nghĩa Thìn và Đặng Thị Sy, Hệ thống thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội, 1998, 250tr.
7. Carl w . Dieffenbach and Gabriela s. Dreksler, PCR prim er a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, 390p.
8. Roger J et al. Extraction of total cellular DNA from plant, algae and fungi. P lant Molecular Biology. Khoner Acedemic Publishers, 1994, 280p.
VNU- JO URN AL OF SCIENC E, Nat., Sci., & Tech., T .x x , N04, 2004
D E S I G N I N G P A I R O F P R I M E R TO A M P L I F Y 1 8 S R R N A G E N E O F TWO Y E L L O W T E A S P E C I E S B E L O N G TO C A M E L L I A G E N U S A T TA M DAO
N A T I O N A L P A R K . ( C A M E L L I A C R A S S I P H Y L L A A N D C A M E L L I A T A M D A O N E N S I S )
N g u y e n Van Mui, N g u y e n T ron g B inh
Department of Biology, College o f Science, VN U
C am ellia g e n u s h a s high economic value. It is n ece ssa ry to a cc urately classify it into correct categories in o rd e r to find out su itab le conservative m e th o d s of cam ellia gene source a n d biodiversity. Typically, it is classified by tra d itio n a l m eth od s b u t it is n e ith e r economic nor accurate. Therefore, m olecular biology m ethods a re employed. To do this, genomic DNA w as first e x tra c te d from two yellow tea species (C am ellia cra ssip h ylla a n d C am ellia ta m daon en sis).
A p a ir of p rim e rs b a se d on conservative sequence a t two te r m in a ls of 18S rRNA gene of high class p la n ts w ere designed.
18S l’RNA gene w as am plified using above p a ir of p rim ers, re s u ltin g in one 1.7kb length band.
l ap chi Khoa học D H Q G IIN . K H TN & CN, T.xx. So 4, 2004
