106 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN DẠI TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE

2020

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN DẠI TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

Đỗ Tuấn Đạt¹, Nguyễn Văn Khải², Nguyễn Văn Chuyên³ TÓM TẮT:

Vắc xin dại sống giảm độc lực tứ giá trên nuôi cấy tế bào Vero do nhóm nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm đã được đánh giá về tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm. Kết quả cho thấy, vắc xin này đều đạt được yêu cầu về tính an toàn, cho đáp ứng miễn dịch tốt và có hiệu quả bảo vệ khi thử nghiệm trên các mô hình động vật khác nhau. Các loạt vắc xin nghiên cứu đều đạt yêu cầu về tính an toàn chung và chất gây sốt khi kiểm tra trên chuột và thỏ. Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở cả 2 dạng đông khô và hấp phụ với nhôm phosphate đều đạt yêu cầu về tính an toàn khi kiểm tra trên động vật thực nghiệm. Kháng thể này tăng cao nhất vào ngày thứ 21 sau đó giảm thấp vào ngày thứ 28. Kháng thể tiếp tục tăng cao cho đến ngày thứ 56 sau khi tiêm liều vắcxin thứ ba. Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm tiêm vắcxin là tương đương nhau, tuy nhiên, nhóm tiêm vắcxin Verorab có hiệu giá kháng thể cao hơn so với các nhóm tiêm vắcxin VERAPVAX và VERALVAX. Kết quả đánh giá tiền lâm sàng vắc xin dại trên các mô hình động vật khác nhau sẽ có tính tham khảo rất tốt trước khi đưa ra các quyết định để thử nghiệm lâm sàng vắc xin trên người sau này.

Từ khóa: Tính an toàn, đáp ứng miễn dịch, vắc xin dại

SUMMARY

ASSESSMENT OF SAFETY AND IMMUNE RESPONSE OF RABIES VACCINES TO ExPERIMENTAL ANIMALS

The live attenuated rabies vaccine on Vero cell cultures produced by the research team at a laboratory scale has been evaluated for safety and immunogenicity in laboratory animals. The results showed that this

vaccine all met the requirements for safety, good immune response and protective effect when tested on different animal models. The studied series of vaccines have met the requirements for the general safety and fever- causing substances when tested on rats and rabbits. The rabies vaccine on Vero cell culture in both lyophilized and adsorbed forms with aluminum phosphate met the safety requirements in testing on experimental animals.

Antibodies are highest on day 21 and then low on day 28.

Antibodies continue to rise until day 56 after a third dose of vaccine is given. The rate of immunological response between the vaccination groups was similar, however, the Verorab vaccination group had higher antibody titres compared with the vaccinated groups VERAPVAX and VERALVAX. The results of a pre-clinical assessment of dengue vaccine on different animal models will be very good for reference before making decisions for future human vaccine clinical trials.

Keywords: Safety, immune response, rabies vaccine.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh dại lưu hành và lây lan ở Việt Nam nhiều năm nay, số người đi tiêm VX phòng dại lên đến gần nửa triệu người với tỷ lệ tiêm phòng xấp xỉ 500/100.000 dân, cao nhất trên thế giới tốn phí hơn 300 tỷ đồng tiền VX hàng năm [1]. Các thử nghiệm an toàn đối với vắcxin dại được thiết kế nhằm phát hiện bất kỳ một chất hay đặc tính nào có hại cho các đối tượng tiêm như việc lây nhiễm các tác nhân ngoại lai, virút chưa bất hoạt hoặc độc tính. Yêu cầu đối với các thử nghiệm này được trình bày trong khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào [2].

Từng quốc gia hay khu vực cũng có những yêu cầu đặc trưng riêng tuy nhiên đều dựa trên căn cứ là các yêu cầu chung do TCYTTG đề ra. Các thử nghiệm kiểm tra chất 1. Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)

2. Đại học Y dược Hải Phòng 3. Học viện Quân y

Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Chuyên; Email: nguyenvanchuyenk40@gmail.com

VI NSC KH EC NG NG

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

lượng tế bào này được tiến hành đối với từng loạt sản xuất chủng giống cũng như loạt sản xuất vắcxin. Đối với các vắcxin dại được phát triển với mục đính sử dụng cho người thì việc đánh giá đáp ứng miễn dịch tiền lâm sàng là cần thiết. Khi tiến hành các thử nghiệm này, cần có sự so sánh về hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vắcxin mới với các vắcxin đã biết rõ về công hiệu cũng như có hiệu quả phòng bệnh tốt trên người. Nghiên cứu này đề cập đến việc đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của các dạng thành phẩm vắcxin dại khác nhau. Các sản phẩm này đều được đánh giá so sánh về đáp ứng miễn dịch với các nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý và tiêm với một vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đã được thương mại hóa cho hiệu quả phòng bệnh tốt trên người (Verorab của Sanofi-Pasteur, Pháp).

Số liệu của bài báo là một phần kết quả nghiên cứu của đề tài cấp Nhà nước: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin, Mã số: KC.10.41/16-20.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp kiểm tra tính an toàn đặc hiệu của vắc xin

a. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

* Dụng cụ: Ống ly tâm 15 ml, bơm tiêm nhựa 1ml, hộp đựng đá.

* Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng: Giống chuột Swiss, Giới: chuột đực hoặc cái, trọng lượng: 12-14 g, số lượng: 10 con / 1 loạt mẫu thử.

b. Các bước tiến hành

* Chuẩn bị chuột

- Chuột trước khi tiêm phải được theo dõi cách ly 2 ngày. Trong thời gian cách ly hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe và ghi vào sổ theo dõi. Chọn chuột trọng lượng 12-14g: 10 con/1 loạt mẫu thử. Đánh dấu chuột, dãn nhãn lên lồng chuột với các chi tiết: Loạt vắc-xin, dấu chuột và ngày tiêm.

* Tiêm chuột

- Sát trùng vị trí tiêm. Dùng bơm tiêm 1ml lấy vắcxin đã hộn ở trên. Với liều tiêm: 0,03ml/1 chuột.

Đường tiêm: Não

* Theo dõi chuột

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.

Hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe và cân trọng lượng cả nhóm chuột vào ngày cuối cùng.

c. Kết quả

- Tính % trọng lượng tăng của từng nhóm chuột: % tăng trọng = ( P14 / PO ) x 100%

Trong đó: P14: trọng lượng của 10 chuột ngày thứ 14. PO: trọng lượng của 10 chuột ngày tiêm.

d. Tiêu chuẩn chấp thuận: Không có chuột nào chết trong suốt thời gian theo dõi và 100% chuột sống khỏe mạnh, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý và tăng cân.

2.2. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên chuột

Thử nghiệm để đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên chuột là thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (RFFIT) phát hiện kháng thể trung hòa đối với virút dại trong các mẫu huyết thanh.

a. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ: Tuýp pha loãng mẫu 1,5 ml, phiến Teflon 3 giếng, bản kính đậy phiến, hộp lồng 15 cm để ủ phiến, Phiến 96 giếng để pha loãng, đầu côn: 20-1000 ml, giấy thấm, Pipet các loại, cóng rửa phiến, hộp đựng đá.

Hóa chất: Chai nuôi cấy tế bào MNA, MEM 10%

FBS, dung dịch Trysin, dung dịch PBS, dung dịch đệm phủ phiến, dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh quang, aceton lạnh, nước pha tiêm.

Mẫu thử: Chủng virút dại thử thách CVS -11, huyết thanh kháng dại chuẩn (2 IU/ml), huyết thanh mẫu thử: 1 ml

Trang thiết bị: Tủ ấm 37⁰C, máy trộn, nồi cách thủy, kính hiển vi soi tế bào, kính hiển vi huỳnh quang, hốt vô trùng.

b. Tiến hành

- Bất hoạt mẫu huyết thanh thử: Mẫu huyết thanh thử được bất hoạt ở nhiệt độ 56⁰C trong 30 phút.

- Chuẩn bị phiến mẫu huyết thanh chứng: Chuẩn bị phiến 96 giếng, mỗi mẫu huyết thanh chứng sẽ được pha loãng trên một hàng dãy dọc của phiến.

- Các mẫu huyết thanh được pha loãng theo các độ pha từ 1/5 đến 1/625.

- Chuyển các mẫu huyết thanh đã được pha loãng vào từng giếng trên các phiến thử. Mỗi phiến nhỏ lần lượt 3 độ pha loãng 1/25; 1/125; 1/625.

- Chuẩn bị phiến mẫu huyết thanh thử: Pha loãng và nhỏ mẫu vào phiến như đối với mẫu huyết thanh chứng.

* Pha loãng và chuẩn bị phiến virút chứng

- Chủng virút thử thách CVS-11 được pha loãng bằng MEM 10% FBS để đạt được nồng độ 50FFD50/0,1 ml.

- Tiếp tục pha loãng 10 lần mẫu virút chứng thêm 2 độ pha loãng 1/10 và 1/100 để đạt được các nồng độ

JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE

2020

- Chuyển các mẫu virút chứng đã được pha loãng này vào từng giếng trên phiến chứng virút.

* Trung hòa huyết thanh với virút thử thách - Nhỏ mẫu virút có nồng độ 50FFD50 vào tất cả các giếng của phiến mẫu huyết thanh thử và huyết thanh chứng.

- Ủ tất cả các phiến ở nhiệt độ 37⁰C trong 90 phút.

* Chuẩn bị và ủ tế bào MNA với mẫu thử

- Tách chai tế bào MNA đã nuôi cấy 3 ngày trong môi trường MEM 10% FBS bằng trypsin để tạo thành hỗn dịch tế bào.

- Đếm số lượng tế bào có trong hỗn dịch. Pha loãng hỗn dịch tế bào để đạt được nồng độ theo yêu cầu.

- Cho hỗn dịch tế bào vào từng giếng trên tất cả các phiến mẫu đã có virút thử thách và 1 phiến không có virút là chứng tế bào.

- Ủ tất cả các phiến ở nhiệt độ 37⁰C trong 20 giờ.

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của virút dại thử thách.

* Cố định virút

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Nhúng phiến trong cóng đựng dung dịch PBS sau đó nhúng tiếp vào cóng đựng acetone lạnh.

- Vớt phiến ra và để khô tự nhiên.

* Nhuộm phiến

- Nhỏ dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh quang vào từng giếng trên các phiến.

- Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 37⁰C trong 30 phút.

* Rửa phiến

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Rửa phiến bằng dung dịch PBS.

- Để khô phiến.

* Phủ phiến

- Nhỏ dung dịch đệm phủ phiến vào từng giếng.

- Đậy phiến bằng bản kính.

* Đọc bản phiến

- Soi phiến dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính

20x và ghi kết quả vào phiếu ghi sơ đồ phiến. Mỗi giếng trên phiến sẽ được soi lần lượt từng vi trường cho hết toàn bộ diện tích của giếng. Vi trường nhiễm là vi trường soi thấy hình ảnh virút dại bắt màu xanh huỳnh quang trên nền tế bào Vero có màu đỏ.

c. Kết quả

- Tính kết quả: Tính số vi trường nhiễm trên tổng số vi trường được soi trong mỗi giếng. Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench.

- Công thức:

Lg(1/FFD50) = Trong đó:

A: Độ pha loãng của mẫu có mức độ nhiễm ngay sát dưới 50%.

a: % vi trường nhiễm ngay sát dưới 50%

b: % vi trường nhiễm ngay sát trên 50%

k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10)

d. Giá trị của thử nghiệm và tiêu chuẩn chấp thuận - Phiến mẫu chứng huyết thanh, chứng virút và chứng tế bào phải đạt được yêu cầu của thử nghiệm. Hiệu giá kháng thể trung hòa đối với virút dại trong huyết thanh từ 0,5 IU/ml trở lên được coi là dương tính.

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật thực nghiệm

Kết quả về tính an toàn chung và an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero được đánh giá trên cả vắcxin thành phẩm dạng đông khô (VERAPVAX) và vắcxin thành phẩm dạng lỏng hấp phụ nhôm (VERALVAX) trình bày trong Bảng 1 và Bảng 2. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX). Kết quả kiểm tra vắc xin thành phẩm tại cơ sở. Trong phần này chỉ trình bày kết quả kiểm tra chất gây sốt của các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ nhôm (VERALVAX) (Bảng 3).

Bảng 1. Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

Kết quả theo dõi sau 7 ngày

Chuột nhắt trắng Chuột lang

VERAPVAX VERALVAX VERAPVAX VERALVAX

Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0210 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0210

Số chuột chết 0/5 0/5 0/5 0/2 0/2 0/2

Trung bình tăng trọng 125,23% 127,77% 116,03% 105,36% 108,14% 110,47%

Kết luận Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu

VI NSC KH EC NG NG

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Tất cả các loạt thử nghiệm đánh giá đều có kết quả đạt yêu cầu về tính an toàn chung.

Kết quả nghiên cứu cho thấy các loạt thử nghiệm đánh giá tính an toàn đặc hiệu đều đạt yêu cầu.

Về kiểm tra tính chất gây sốt trên thỏ, đạt yêu cầu ở tất cả các lần thử.

Theo kết quả trong Bảng 1, Bảng 2 và Bảng 3, vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở cả 2 dạng đông khô và hấp phụ với nhôm phosphate đều đạt yêu cầu về tính an toàn khi kiểm tra trên động vật thực nghiệm.

3.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trên động vật thí nghiệm

Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero được sử dụng trong nghiên cứu là vắcxin được sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm dưới hai dạng thành phẩm khác

nhau là vắcxin đông khô (VERAPVAX) và vắcxin hấp phụ với nhôm phosphate (VERALVAX). Các vắcxin này được đánh giá so sánh về đáp ứng miễn dịch với các nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý và nhóm tiêm một vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đã được thương mại hóa có hiệu quả phòng bệnh cao trên người (Verorab của Sanofi-Pasteur, Pháp). Giống chuột được lựa chọn trong nghiên cứu này là chuột NMRI. Đây là giống chuột được nhiều nhà sản xuất sử dụng để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào [3].

Bảng 2. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

Kết quả theo dõi sau 14 ngày VERAPVAX VERALVAX

Loạt 0209 Loạt 0309 Bán thành phẩm Loạt 0210

Số chuột chết, liệt hoặc có bệnh lý 0/10 0/10 0/10

Trung bình tăng trọng 212,09% 224,53% 206,26%

Kết luận Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu

Bảng 3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) Sản phẩm Nhiệt độ tăng của từng thỏ Tổng nhiệt độ

tăng Kết luận

Thỏ 1 Thỏ 2 Thỏ 3

Tiêu chuẩn <0,6⁰C <1,4⁰C Đạt yêu cầu

Loạt 0110 0,4⁰C 0,1⁰C 0,3⁰C 0,8⁰C Đạt yêu cầu

Loạt 0210 0,2⁰C 0,4⁰C 0,1⁰C 0,7⁰C Đạt yêu cầu

Loạt 0310 0,3⁰C 0,3⁰C 0,1⁰C 0,7⁰C Đạt yêu cầu

JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE

2020

* Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch là tỷ lệ giữa số chuột có kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virút dại dương tính trên tổng số chuột được gây miễn dịch.

Mức độ đáp ứng miễn dịch được xác định bằng giá trị trung bình nhân (GMT) của các hiệu giá kháng thể kháng virút dại tính theo IU/ml.

Kết quả trong Bảng 4 cho thấy chuột nhắt trắng NMRI là mô hình thực nghiệm thích hợp để đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero.

Sau 2 liều tiêm đầu tiên vào ngày 0 và 7, hầu hết chuột (90%) ở tất cả ba nhóm tiêm vắcxin đã có được đáp ứng miễn dịch bảo vệ.

Kháng thể này tăng cao nhất vào ngày thứ 21 sau đó giảm thấp vào ngày thứ 28. Kháng thể tiếp tục tăng cao cho đến ngày thứ 56 sau khi tiêm liều vắcxin thứ ba. Kết quả này tương tự với nhiều nghiên cứu khác đã được tiến hành trên động vật sau khi tiêm các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero [4], [5] hoặc tế bào phôi gà [6]. Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm tiêm vắcxin là tương đương nhau, tuy nhiên, nhóm tiêm vắcxin Verorab có hiệu giá kháng thể cao hơn so với các nhóm tiêm vắcxin VERAPVAX và VERALVAX. Tuy nhiên, có được đáp

ứng miễn dịch bảo vệ sớm với hiệu giá kháng thể ≥0,5 IU/

ml mới là yếu tố chính để đánh giá về hiệu lực của vắcxin dại. Kháng thể sớm sẽ giúp trung hòa virút ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể, giúp ngăn chặn sự lây lan và phát tán của virút theo hệ thống thần kinh từ đó gây ra các bệnh lý nghiêm trọng [7].

IV. KẾT LUẬN

Kết quả đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin trên động vật thí nghiệm cho thấy vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào sản xuất theo qui trình đã được xây dựng đều đạt yêu cầu về an toàn và công hiệu. Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ với nhôm đạt yêu cầu về tính an toàn chung, an toàn đặc hiệu và chất gây sốt khi kiểm tra trên động vật thực nghiệm.

Các dạng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero thành phẩm được nghiên cứu sản xuất cho đáp ứng miễn dịch qua các liều tiêm đều tương đương so với vắcxin đã được thương mại (Verorab). Kết quả đánh giá tiền lâm sàng vắc xin dại trên các mô hình động vật khác nhau sẽ có tính tham khảo rất tốt trước khi đưa ra các quyết định để thử nghiệm lâm sàng vắc xin trên người sau này.

Bảng 4. So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab

Ngày đánh giá Chỉ số VERAPVAX

Loạt 0309 VERALVAX

Loạt 0210 Verorab Chứng âm Ngày 7 Tỷ lệ* 7/10 (70%) 9/10 (90%) 9/10 (90%) 0/10 (-)

Mức độ# 1,15 1,66 4,30 0,22

Ngày 14 Tỷ lệ* 9/10 (90%) 9/10 (90%) 9/10 (90%) 0/10 (-)

Mức độ# 10,64 11,53 21,50 0,30

Ngày 21 Tỷ lệ* 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Mức độ# 17,81 17,96 24,20 0,22

Ngày 28 Tỷ lệ* 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Mức độ# 4,41 4,06 14,02 0,32

Ngày 42 Tỷ lệ* 10/10 (80%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Mức độ# 3,99 8,80 18,25 0,12

Ngày 56 Tỷ lệ* 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Mức độ# 2,69 10,23 27,85 0,33

VI NSC KH EC NG NG

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chính phủ (2017), Quyết định số 193/QĐ-TTg phê duyệt “Chương trình Quốc gia khống chế và tiến tới loại trừ bệnh dại giai đoạn 2017-2021”.

2. WHO, “WHO Expert Consultation on Rabies,” Third report, 2018.

3. E. Fuenzalida, R. Palacios, J. M. Borgoño (1964), “Antirabies antibody response in man to vaccine made from infected suckling-mouse brains,” Bull World Health Organ, 30(3), pp. 431-436.

4. Ashwathnarayana DH, Madhusudana SN, Sampath G, Sathpathy DM, Mankeshwar R, Ravish. HH (2009),

“A comparative study on the safety and immunogenicity of purified duck embryo cell vaccine (PDEV, Vaxirab) with purified chick embryo cell vaccine (PCEC, Rabipur) and purifed vero cell rabies vaccine (PVRV, Verorab),” Vaccine, 28(1), pp. 148-151.

5. Anuradha Bose, Renuka Munshi, Radha Madhab Tripathy, Shampur N. Madhusudana, B.R. Harish et al (2016), “A randomized non-inferiority clinical study to assess post-exposure prophylaxis by a new purified vero cell rabies vaccine (Rabivax-S) administered by intramuscular and intradermal routes,” Vaccine, 34(40), pp. 4820-4826.

6. Sehgal S, Bhattacharya D, Bhardwaj M (1995), “Ten years longitudinal study of efficacy and safety of purified chick embryo cell vaccine for pre- and post-exposure prophylaxis of rabies in Indian population,” The Journal of Communicable Diseases, 27(1), pp. 36-43.

7. Prasad S. Lulkarni, Amita Sapru, Pradeep M.D’costa, Anand Pandit, Shampur N. Madhusdana et al (2013),

“Safety and immunogenicity of a new purified vero cell rabies vaccine (PVRV) administered by intramuscular and intradermal routes in healthy volunteers,” Vaccine, 31 (24), pp. 2719 - 2722.