PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Streptococcus iniae TRÊN CÁ CHẼM (Lates calcarifer)
ISOLATION, IDENTIFICATION, AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING OF Streptococcus iniae ISOLATED FROM ASIAN SEA BASS (Lates calcarifer)
Nguyễn Bảo Trung*, Trần Hữu Tính, Trần Thị Tuyết Hoa và Từ Thanh Dung Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ
Email: ttdung@ctu.edu.vn
ABSTRACT
Streptococcosis or “popeye” disease is causing severe losses in marine fish production globally. The aim of this study was to characterize Streptococcus iniae isolated from Asian sea bass (Lates calcarifer) cultured in tanks in VungTau province, Vietnam. A total number of thirty sea bass (250-600 gr), with clinical signs of listless swimming, unilateral and bilateral exophthalmia, skin hemorrhages and pale livers were sampled. Bacterial isolates wereperformed from the liver, kidney, spleen, brain and eye of diseased fish. The inoculating loops were streaked onto brain heart infusion agar (BHIA) and blood agar (BA) supplemented with sodium chloride at the concentration of 15‰. Bacterial cultures were incubated at 28°C for 24hrs. Grampositive cocci, chain-forming, small and opaque colonies and beta- haemolytic bacterial isolateswere identified as Streptoccocus iniae,using biochemical tests, rapid identification systems and 16S rRNA gene partial sequencing. Antimicrobial susceptibility testing was performed with ten antibiotics, using the standardized disc diffusion method. The results showed that the selected bacterial isolates showed the highest sensitivity to cefotaxime (CXT), doxycycline (DO), erythromycin (E) and florfenicol (FFC), but were completely resistant to colistin sulfate (CS) and fluminquine (UB). The minimal inhibitory concentrations (MICs) were also determined in this study.
Key words: Streptococcus iniae, sea bass, Lates calcarifer, antimicrobial susceptibility.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cá chẽm (Lates calcarifer) là loài cá khả năng thích nghi rộng rất rộng muôi, và sinh trưởng nhanh. Cá chẽm đã được bắt đầu nuôi từ những năm 1970 ở Thái Lan, và sau đó lan rộng ra nhiều nước Đông Nam Á do giá trị kinh tế và nhu cầu thị trường cao (FAO, 2012). Ở Việt Nam, người ta bắt đầu nuôi cá chẽm từ những năm 1990 với quy mô nhỏ do thiếu con giống.
Hiện nay, cá chẽm được xem như là vật nuôi xóa đói giảm nghèo và là đối tượng nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta. Hiện nay chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta, nhưng qua tìm hiểu thông tin từ các báo cho thấy cá chẽm đã nuôi thành công ở một số nơi như ở Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa) Hương Trà (Thừa Thiên Huế), Hà Tĩnh, Đồng Nai, Bình Định, Cà Mau (Phúc, 2011). Tuy nhiên, các loại bệnh và sự nghiêm trọng của bệnh đã ảnh hưởng đến các loài cá nuôi. Cá nuôi lồng sẽ trở nên dễ mắc bệnh khi mà các thông số môi trường như nhiệt độ, độ mặn, nồng độ oxy hòa tan và các chất lơ lửng... thay đổi nhiều hoặc đột ngột. Chỉ cần một điều kiện thích hợp cho bệnh cũng có thể tạo điều kiện cho bệnh phát triển, quá trình dẫn tới bệnh ở môi trường nước xảy ra rất nhanh. Việc xác định sớm sự thay đổi hoạt động và dấu hiệu của bệnh ở cá nuôi là rất quan trọng để chẩn đoán bệnh
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thu mẫu
Trong nghiên cứu này, mẫu cá chẽm bệnh được thu từ 42 bể các composite và bể xi măng, nuôi công nghiệp ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, Việt Nam. Mẩu cá có trọng lượng từ 250-600 gram/con, có dấu hiệu bơi lờ đờ, mắt phồng to một bên hoặc cả hai bên, kèm theo xuất huyết da, và gan bị tái đã được thu và phân tích trực tiếp tại phòng thí nghiệm của trại nuôi.
Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ năm cơ quan của cá bệnh, bao gồm gan, thận, tì tạng, não, và mắt; được nuôi cấy trên môi trường thạch máu (BA), và nước thịt BHIA (Brain heart infusion agar) có bổ sung1,5% NaCl (BHI-A+). Hầu hết các đĩa môi trường này, sau khi ủ ở28°C trong 24-48 giờ trong tủ ấm, xuất hiện nhiều khuẩn lạc thuần, trắng dục, nhỏ li ti.
Tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản: Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả năng sử dụng đường trong điều kiện hiếu khí và yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993), và Buller (2004). Đồng thời, sử dụng bộ kít API 20Strep (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn.
Phương pháp lập kháng sinh đồ
Nghiên cứu đã tiến hành xác định khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn đối với 10 loại kháng sinh: ampicillin (AMP/25µg), cefotaxime (CTX/30µg), colistin (CS/30µg), doxycycline (DO/30µg), enrofloxacin (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), flumequine (UB/30µg), norfloxacin (NOR/5µg), rifampicin (RD/30µg), sulphamethoxazole/trimethoprim (SXT/25µg), (Oxoid, UK). Phương pháp lập kháng đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute, M2-A09 (CLSI, 2006). Sử dụng môi trường BHIA (bổ sung thêm 1,5% NaCl) được ủ ở 28°C trong 24-48 giờ sẽ tiến hành đo đường kính vòng tròn vô trùng (mm) nhằm xác định tính kháng nhạy của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp pha loãng dung dịch Clinical and Laboratory Standards Institue, M49-P (CLSI, 2006), pha loãng với 6 loại kháng sinh tinh: colistin, enrofloxacin, erythromycin, florfenicol, oxytetracycline, trimethoprim, (Sigma) ở các nồng độ: 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 µg/mL, đối chứng dương (có vi khuẩn) và đối chứng âm (không có vi khuẩn). Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trên môi trường BHI-B (Brain heart infusion broth) có bổ sung 1,5% NaCl. (BHI-B+) .
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá Chẽm
Nghiên cứu này đã tiến hành thu mẫu cá chẽm bị bệnh trong bể xi-măng: Vũng Tàu. Kết quả phân lập được 23 chủng vi khuẩn từ 40 cá chẽm bị bệnh.
Cá chẽm bị bệnh có dấu hiệu giống nhau, ở nhiều mức độ: cá bệnh thường bơi lờ đờ. Việc quan sát dấu hiệu bên ngoài cho thấy cá thường bơi lội mất định hướng (lội đĩa), xuất huyết ởvây ngực và phần bụng, đôi khi ở những cá thể bị nặng thì mắt lồi và đục một bên, hoặc cả hai bên (Hình 1.A). Đó là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus gây ra, từng được miêu ta bởi nhiều tác giả khác như Bromage(1999), Creeper và Buller (2006), Baeck(2006), Aamri (2010), Suanyuk (2010). Nội quan của những con cá này cũng thể hiện những dấu hiệu khác thường như: gan bị tái, thận và tì tạng sưng (Hình 1.B).
Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá chẽm bệnh thu được 23 chủng vi khuẩn trên môi trường BHIA (bổ sung 1,5% NaCl) được ủ ở 28°C trong 24 giờ. Vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc trắng đục, tròn hơi lồi, nhỏ li ti (0.5-1 mm). Vi khuẩn này thuộc Gram dương, hình cầu hoặc chuỗi, có khả năng dung huyết dạng β trên môi trường thạch máu, âm tính với oxidase, catalase, O/F, không di động, khả năng sử dụng đường trong môi trường hiếu khí, yếm khí,catalase và oxidase âm tính (Bảng 1).
Hình 1: A: Cá chẽm biểu hiện lồi mắt (mũi tên); B: Gan thận và tỳ tạng sưng to (mũi tên)
Bảng 1: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn gây bệnh trên phù mắt cá chẽm Chỉ tiêu S. iniae (Buller, 2004) S. iniae phân lập
Gram dương Dương
Hình dạng cầu, chuỗi cầu, chuỗi
Kích thước khuẩn lạc 1 mm 0.5-1 mm
Thời gian phát triển 24-48 giờ 24-36 giờ
Dung huyết Β Β
Di động - -
Catalase - -
ADH - -/+
Oxidase - -
O/F -/- -/-
Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn trong nghiên cứu này bằng bộ kit API 20Strep (Microbank™, PRO-LAB Diagnostics, UK) được trình bày qua Bảng 2.
Bảng 2: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kit API 20Strep
Chỉ tiêu S. iniae (Buller, 2004) S. iniae phân lập
VP Voges Proskauer - -
HIP HIPpuric acid - -
ESC Esculin + +
PYRA PYRrolidonyl
Arylamidase + +
GAL α-GALactosidase - -
GUR ß-GlUcuRonidase + +
GAL ß-GALactosidase - -
PAL ALkaline Phosphatase + +
LAP Leucine
AminoPeptidase + +
ADH Arginine DiHydrolase - -/+
RIB RIBose + +
ARE ARAbinose - -
MAN MANnitol + +
SOR SORbitol - -
A B
TRE TREhalose + +
INU INUlin - -
RAF RAFfinose - -
AMD AmiDon + +
GLYG Glycogen + +
Ghi chú: dương tính (+), âm tính (-)
Kết quả kháng sinh đồ
Việc đối chiếu đường kính vùng tròn vô trùng trong nghiên cứu với các số liệu tham khảo trong CLSI M2-A09 đã cho thấy: các chủng S. iniae phân lập được kháng hoàn toàn với colistin và flumenquin. Dù vậy, các chủng này nhạy với hầu hết các loại kháng sinh, hình thành vùng tròn vô trùng có kích thước lớn,và đặc biệt nhạy đối với erythromycin và doxycycline.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh lên các chủng S. iniae trong nghiên cứu được tóm tắt qua Bảng 3. Các số liệu đã thể hiện được sự tương đồng về sự kháng và nhạy của vi khuẩn trong kiểm tra định tính (kháng sinh đồ) và định lượng (MIC). Trong đó,S. iniae kháng colistin, thể hiện qua giá trị MIC rấtcao (>512µg/mL). Nồng độ MIC của các loại kháng sinh còn lại rất thấp, thể hiện tính nhạy cao của các chủng S. iniae đối với các loại kháng sinh, và đặc biệt nhạy với erythromycin (MIC = 0.0325µg/mL).Các kết quả về tính kháng thuốc của các chủng S. iniae trong nghiên cứu lần này cũng phù hợp với các kết quả gần đây của Yon-Kyoung và ctv (2009), và Suanyuk và ctv (2010).
Bảng 3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Kháng sinh (µg/mL) E ENR O TMP FFC CT
M2B15 0.25 0.25 0.25 1 4 128
M2B17 0.0325 0.25 0.5 0.125 4 >512
Ghi chú: TMP: Trimethoprim, E: Erythromycin, ENR: Enrofloxacin; O: Oxytetracyclin;
FFC: Florfenicol, CT: Colistin
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu phân lập vi khuẩn trên 20 mẫu cá chẽm thu ở Vũng Tàu, đã thu được 13 chủng vi khuẩn Streptocuccus iniae với cá có dấu hiệu bệnh lý: bơi mất định hướng, mắt lồi và đục, xuất huyết ở vây và phần bụng. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn S. iniae phân lập trên cá chẽm thì kháng với khánh sinh: colistin sulfate (CS), flumequine (UB) và tỏ ra nhạy với các kháng sinh erythromycin (E), cefotaxime (CXT), doxycycline (DO) và florfenicol (FFC). Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng vi khuẩn gây bệnh thấp (<0,25µg/mL) với các loại thuốc kháng sinh enrofloxacin, erythromycin và oxytetracyclin và giá trị MIC cao trên kháng sinh colistin (>512µg/mL).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phúc. V.Đ, 2011. Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại nha trang - khánh hòa
Aamri, F. E., D. Padilla, F. Acosta, M. J. Caballero, J. Roo, J, Brabo, J. Vivas and F. Real, 2012. Frist report of Streptococcus iniae in red progy (Pagrus pagrus, L.). Journal of Fish Disease 2012, 33. 901-905
Baeck, G. W., J. H. Kim, D. K. Gomez, S. C. Park, 2006. Isolation and characterization of Streptococcus sp. From diseased flounder (Paralichthys olivaceus) in Jeju Island. Journal of Veterinary Science (2006), 7(1). 53-58
Bromage, E. S., A. Thomas, L. Owens, 1999. Streptococcus iniae, a bacterial infection in baramundi Lates calcarifer. Diseases of Aquatic Organisms Volume 36: 177-181, 1999 Creeper, J. H., and N. B. Buller, 2006. An outbreak of Streptococcus iniae in baramundi (Lates calcarifer) in freshwater cage culture. Australian Vetirinary Journal Volume 84, No 11, November 2006.
FAO.© 2006-2012.Cultured Aquatic Species Information Program.Lates calcarifer. Cultured Aquatic Species Information Program. Text by Rimmer, M.A. In: FAO Fisheries and Aquaculture Department [online]. Rome. Updated 3 June 2006. [Cited 27 May 2012].
http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en#tcNA0019
G. Nicolas Frerichs and Stuart D. Millar, 1993. Manual for The Isolation and Identification of Fish Bacterial Pathogens. Pisces Press, Stirling.
Nicky Buller, 2004. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals – A Practical Identification Manual. CABI Publishing
Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Proposed Guideline.CLSI document M49-P [ISBN 1-56238-577-1]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Ninth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute document M2-A9 [ISBN 1-56238-586-0]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2006.
