Phương pháp phát hiện đột biến gen TP53

1.7.4. Phương pháp phát hiện đột biến gen TP53

ở trong nhân tế bào, vì thế khi nhuộm HMMD thì nhân tế bào sẽ bắt màu, trong khi ở các tế bào bình thường, lượng protein p53 biểu hiện ít nên không cho thấy sự bắt màu đặc trưng và có các đặc điểm: (1) có sự biểu hiện vượt mức protein p53; (2) protein p53 biểu hiện phải được tích lũy trong nhân tế bào; (3) không có đột biến và không có sự biến đổi cấu trúc protein tại vị trí epitop gắn đặc hiệu trên protein p53. Vì có đến 80% các đột biến nhầm nghĩa tạo ra các protein p53 đột biến được tích lũy trong nhân nên phương pháp này được xem là phương pháp nhận diện trực tiếp protein đột biến có độ tin cậy cao. Tuy nhiên, các đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung lại thường không tạo ra các protein được tích lũy trong nhân. Vì thế, các kháng thể đánh dấu không thể gắn được vào epitop của các protein đột biến [73].

1.7.4.2. Kỹ thuật sinh học phân tử PCR và realtime PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào. Nhà hóa sinh người Mỹ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in-vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gen.

Realtime PCR: là phương pháp khuếch đại gen gồm 2 quá trình: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng DNA tạo ra. Ưu điểm của Realtime PCR là cho kết quả nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng DNA đã tạo thành ở từng thời điểm, không cần điện di do đó tiến hành được nhiều mẫu, hạn chế tạp nhiễm, có độ nhạy cao. Realtime PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng của Taq DNA polymerase do Holand và CS công bố năm 1991.

So với PCR truyền thống, Realtime PCR có ưu điểm:

- Kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được sản phẩm PCR tại từng thời điểm của quá trình khuếch đại.

- Độ dặc hiệu của Realtime PCR cao hơn nhiều so với PCR truyền thống do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện các sản phẩm khuếch đại.

1.7.4.3. Giải trình t gen (DNA sequencing)

Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.

Hỗn hợp của deoxy - và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.

Nucleotide tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.

Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên thạch acrylamide có độ phân giải cao, cho phép phân biệt

được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1 nucleotide. Trình tự các nucleotide được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotide.

Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện di thường là điện di mao quản.

Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận biết được từng loại nucleotide và trình tự của DNA đích.

Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank (National Center for Biotechnology Information - NCBI).

Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotide, thay thế nucleotide, thêm nucleotide trên gen. Do phần lớn các đột biến gen TP53 là đột biến điểm nên phương pháp giải trình tự gen TP53 vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến của gen gây bệnh.

Hình 1.10: Hình ảnh giải trình t gen trên máy giải trình t gen t động (Nguồn Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội)