Tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A và 1173C>T

3.1.3. Tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A và 1173C>T ở

Hình A

Hình B

Hình 3.2. Hình ảnh giải trình tự giải trình exon 7 xác định SNP CYP2C9*3 của gen CYP2C9

Hình A. Kiểu gen AA (Bệnh nhân Nguyễn Văn D), Hình B. Kiểu gen AC (Bệnh nhân Đỗ thị M)

Nhận xét:

Sản phẩm giải trình tự rõ nét, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng và không có tín hiệu nhiễu. Khi so sánh với trình tự gen CYP2C9 trên GeneBank cho thấy kiểu gen CYP2C9*1*1 có một đỉnh nucleotid A duy nhất tại vị trí nucleotid thứ 2 của codon 359 (Hình A). Kiểu gen CYP2C9*1*3 có hai đỉnh nucleotid A và nucleotid C (Hình B).

Từ kết quả giải trình tự đa hình đơn nucleotid CYP2C9*3 trên 284 bệnh nhân sau thay van tim cơ học đang dùng thuốc chống đông acenocoumarol, chúng tôi thu được kết quả về tần số alen, kiểu gen của đa hình trên như sau:

Bảng 3.12. Tần số alen và kiểu gen CYP2C9*3 ở nhóm nghiên cứu Kiểu gen

CYP2C9*3 Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Alen *1 Alen *3

CYP2C9 *1*1 270 95,1

0,975 0,025

CYP2C9 *1*3 14 4,9

CYP2C9 *3*3 0 0

Nhận xét:

Kết quả phân tích đa hình gen CYP2C9*3 cho thấy alen biến dị CYP2C9*3 là khá hiếm trong nhóm nghiên cứu (0,025), kiểu gen dị hợp CYP2C9 *1*3 chỉ chiếm 4,9%, đặc biệt không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp biến dị CYP2C9*3*3. Như vậy, alen và kiểu gen nguyên thủy vẫn chiếm đa số trong nghiên cứu.

3.1.3.2. Tần số alen và kiểu gen VKORC1-1639G>A ở nhóm nghiên cứu Để xác định tần số alen, kiểu gen của VKORC1-1639G>A nằm trên vùng promorter của gen VKORC1, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại gen được kiểm tra bằng điện di trên gel aragose 1,5%.

Hình 3.3. Điện di sản phẩm phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP VKORC1-1639G>A

(Ghi chú: Làn (M): Marker 250 - 10.000 bp. Làn 01, 02: Sản phẩm phản ứng khuếch đại của bệnh nhân nghiên cứu. Làn (+): Mẫu biết trước kích thước 771bp làm đối chứng dương. Làn (-): Nước cất làm đối chứng âm)

Nhận xét:

Trên gel điện di, các mẫu DNA tạo thành một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ, không bị đứt gẫy có kích thước 771bp.

Sản phẩm PCR được tinh sạch, giải trình tự và phân tích bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn của gen VKORC1 trên GeneBank.

Hình A

Hình B

Hình C

Hình 3.4. Hình ảnh giải trình tự vùng promoter xác định SNP VKORC1-1639G>A của gen VKORC1

Ghi chú: Hình A. Kiểu gen AA (Bệnh nhân Lê Minh H), Hình B. Kiểu gen AG (Bệnh nhân Bùi Thị H), Hình C. Kiểu gen GG (Bệnh nhân Trần Hữu T) Nhận xét:

Sản phẩm giải trình tự rõ nét, không có tín hiệu nhiễu, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng. Khi so sánh với trình tự gen VKORC1

trên GeneBank cho thấy kiểu gen VKORC1 -1639AA có một đỉnh nucleotid A duy nhất tại vùng promoter (Hình A). Kiểu gen VKORC1 -1639GA có hai đỉnh nucleotid G và nucleotid A (Hình B). Kiểu gen VKORC1 -1639GG có một đỉnh nucleotid G duy nhất (Hình C).

Từ kết quả giải trình tự xác định đa hình gen VKORC1 -1639G>A trên 284 bệnh nhân sau thay van tim cơ học đang dùng thuốc chống đông acenocoumarol, chúng tôi thu được kết quả về tần số alen, kiểu gen của đa hình trên như sau:

Bảng 3.13.Tần số alen và kiểu gen VKORC1-1639G>A Kiểu gen

VKORC1-1639G>A Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Alen G Alen A

VKORC1-1639GG 3 1,1

0,137 0,863

VKORC1-1639GA 72 25,4

VKORC1-1639AA 209 73,6

Nhận xét:

Kết quả phân tích đa hình gen VKORC1-1639G>A trên tổng số 284 bệnh nhân sau thay van tim cơ học cho thấy tần số xuất hiện alen biến dị (A) cao hơn alen kiểu dại (G) (0,863 và 0,137). Bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp biến dị (AA) chiếm đa số trong nghiên cứu với 73,6%, kiểu gen dị hợp (GA) là 25,4% và đặc biệt kiểu gen đồng hợp kiểu dại (GG) chiếm rất ít trong nghiên cứu với 1,1%.

3.1.3.3. Tần số alen và kiểu gen VKORC1 1173C>T ở nhóm nghiên cứu

Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thực hiện nhằm khuếch đại đoạn gen chứa SNP VKORC1 1173C>T nằm trên intron 1 của gen VKORC1.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel aragose 1,5%.

Hình 3.5. Điện di sản phẩm phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP VKORC1 1173C>T

(Ghi chú: Làn (M): Marker 250 - 10.000 bp. Làn 01, 02: Sản phẩm phản ứng khuếch đại của bệnh nhân nghiên cứu. Làn (+): Mẫu biết trước kích thước 714bp làm đối chứng dương. Làn (-): Nước cất làm đối chứng âm) Nhận xét:

Kết quả điện di trên gel aragose cho thấy các mẫu DNA tạo thành một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ, không bị đứt gẫy. Sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa SNP VKORC1 1173C>T cho băng điện di duy nhất có kích thước 714 bp.

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch, giải trình tự và được phân tích bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn trên GeneBank của gen VKORC1:

Hình A

Hình B

Hình C

Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP VKORC1 1173C>T (rs9934438)

Ghi chú: Hình A. Kiểu gen AA/TT (Bệnh nhân Nghiêm Thị H), Hình B.

Kiểu gen AG/TC (Bệnh nhân Nguyễn Văn Q), Hình C. Kiểu gen GG/CC (Bệnh nhân Chu Văn D)

Nhận xét:

Sản phẩm giải trình tự rõ nét, không có tín hiệu nhiễu, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng. Khi so sánh với trình tự gen VKORC1 trên GeneBank cho thấy kiểu gen VKORC1 1173TT có một đỉnh nucleotid A/T duy nhất tại vùng intron của gen VKORC1 (Hình A). Kiểu gen VKORC1 1173CT có hai đỉnh nucleotid C/G và nucleotid T/A (Hình B), kiểu gen VKORC1 1173CC có một đỉnh nucleotid C/G duy nhất (Hình C).

Từ kết quả giải trình tự xác định SNP VKORC1 1173C>T trên 284 bệnh nhân sau thay van tim cơ học đang dùng thuốc chống đông acenocoumarol, chúng tôi thu được kết quả về tần số alen, kiểu gen của các đa hình trên như sau:

Bảng 3.14. Tần số alen và kiểu gen VKORC1 1173C>T ở nhóm nghiên cứu Kiểu gen VKORC1

1173C>T

Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Alen C Alen T

VKORC1 1173CC 6 2,1

0,109 0,891

VKORC1 1173CT 50 17,6

VKORC1 1173TT 228 80,3

Nhận xét:

Khi phân tích đa hình gen VKORC1 1173C>T, chúng tôi ghi nhận alen biến dị (T) xuất hiện với tần số khá cao (0,891), ngược lại alen kiểu dại (C) lại khá ít trong nhóm nghiên cứu (0,109). Về tỷ lệ phân bố các kiểu gen của VKORC1 1173C>T cho thấy, kiểu gen VKORC1 1173TT là chủ yếu trong nghiên cứu chiếm 80,3%, kiểu gen dị hợp thấp hơn với 17,6%, đồng hợp kiểu dại chiếm ít nhất với 2,1%.

3.1.3.4. Tần số kiểu gen phối hợp của gen VKORC1 -1639G>A, 1173C>T ở nhóm nghiên cứu

Hình 3.7. Tần số kiểu gen phối hợp của VKORC1 -1639G>A và VKORC1 1173C>T ở nhóm nghiên cứu

Nhận xét:

Trong tổng số 284 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, tỷ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp biến dị ở cả hai SNP VKORC1 -1639G>A và VKORC1 1173C>T là AA+TT chiếm đa số trong nghiên cứu với 73,2%, kiểu gen dị hợp (GA+CT) chiếm 17,3%, đồng hợp kiểu dại (GG+CC) chiếm 1,1%, các kiểu gen khác như (GA+TT), (GA+CC) và (AA+CT) chiếm lần lượt là 7%, 1,1% và 0,4%. Đặc biệt, không xuất hiện kiểu gen AA+CC, GG+CT, GG+TT trong quần thể nghiên cứu.

3.2. Mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đa hình gen