Kỹ thuật MLP (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Kỹ thuật MLPA (khuếch đại đa đoạn dò) được mô tả lần đầu vào năm

2002 bởi Schouten J.P. và CS, đây là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ bằng 1 cặp mồi [45].

Đến nay có hơn một triệu phản ứng MLPA được thực hiện mỗi năm trên khắp thế giới và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người, di truyền tế bào và ung thư, cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng và chính xác. Trong những năm gần đây, MLPA

I

II

1

1 2 3

Chứng nữ

Exon 19

Exon 50

I

II

1

1 2 3

Chứng nữ

Exon 19

Exon 50

là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn ngắn, lặp đoạn cũng như phát hiện dị hợp tử với độ chính xác cao và cho kết quả nhanh chóng.

* Nguyên t c của kỹ thuật MLP :

- Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai hóa với phân tử DNA đích đặc hiệu và vấn đề thiết kế các probe rất quan trọng [46, 47].

Mỗi đoạn dò gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (gọi là đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược).

+ Đoạn dò xuôi:

Đầu 5’: chứa 19 nucleotide với trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí gắn mồi Y để khuếch đại probe khi tiến hành tất cả các phản ứng PCR.

Đầu 3’: chứa 21-30 nucleotid có trình tự đặc hiệu với đoạn DNA đích (gọi là trình tự lai) và sẽ lai với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai.

+ Đoạn dò ngược: gồm 3 phần

Đầu 3’: gồm 36 nucleotid với trình tự giống nhau cho tất cả các probe, là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe.

Đầu 5’: chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích.

Phần nối giữa đầu 5’ với đầu 3’: là đoạn đệm nằm giữa đầu 3’ và đầu 5’, chứa 19 - 370 nucleotid và được thiết kế dài ngắn khác nhau ở các đoạn dò tùy loại tác nhân đích. Trình tự nucleotide không đặc hiệu với DNA đích nên không gắn vào DNA đích.

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích

Biến tính

PCR

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích

Biến tính

PCR

Hình 1.17. Nguyên t c của kỹ thuật MLP

(Nguồn: Schouten J.P. et al, Nucleic acid es, 30(12)z, e 57)

- Các đoạn probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích, sau đó enzym ligase được thêm vào để nối hai đoạn probe này lại với nhau tạo thành đoạn probe hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

- Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch đại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản (mồi được đánh dấu huỳnh quang).

Phân tích kết quả MLPA là bước quan trong trong kỹ thuật. Phân tích được tiến hành dựa trên hành ảnh, dữ liệu thô tương ứng với từng probe.

Các công cụ tiến hành phân tích MLPA bao gồm:

- Đánh giá trực tiếp qua hình ảnh và dựa vào tính toán chiều cao của các đỉnh (peak area) tương ứng với mỗi exon.

- Sử dụng các phần mềm : Gene Marker, Coffalyser.., hoặc phân tích tương quan cường độ tín hiệu từng exon của bệnh nhân so với nhóm chứng.

(Coffalyser.Net website) [44].

Nếu exon bị đột biến xóa đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy hình ảnh exon bị đột biến xóa đoạn gen.

Nếu có lặp đoạn gen, trên hình ảnh điện di ta thấy đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với exon bị đột biến tăng cao khác biệt so với người bình thường.

* Ứng d ng trong chẩn đoán bệnh DMD:

Cho đến nay, kỹ thuật MLPA là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến gen Dystrophin và phát hiện người lành mang gen bệnh.

Kỹ thuật MLPA với khả năng khuếch đại đồng thời 40 - 45 probe trong mỗi phản ứng PCR chỉ với một cặp mồi duy nhất và chỉ cần tiến hành 2 phản ứng PCR thì đột biến ở 79 exon của gen Dystrophin sẽ được khảo sát, từ đó giúp chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen, lặp đoạn gen Dystrophin và phát hiện người nữ mang gen bệnh với độ chính xác cao và cho kết quả nhanh chóng.

Nghiên cứu của Janssen B. (2005), Marzese D.M. (2008), Li H. (2009) cho thấy kỹ thuật MLPA có thể phát hiện đột biến xóa đoạn với độ chính xác cao và nhanh hơn so với multiplex PCR và FISH, ngoài ra MLPA còn chẩn đoán được lặp đoạn gen và giúp phát hiện người lành mang gen bệnh [48-50].

Hình 1.18. Kết quả MLP phát hiện xóa o n gen DMD exon 48-50 Mẫu bệnh nhân có 3 đỉnh bị m t so với mẫu chứng, tương ứng với exon 48, 49, 50.

Mẫu người mẹ có 3 đỉnh bị giảm chiều cao ½ so với mẫu chứng tương ứng exon 48, 49, 50.

(Nguồn: Lai K.K, 2006)

Hình 1.19. Kết quả MLP phát hiện ột biến lặp o n gen Đỉnh của probe tương ứng với exon 62 ở bệnh nhân cao g p đôi so với chứng nam chứng t bệnh nhân có đột biến lặp đoạn exon 62.

(Nguồn: Trung tâm Nghiên cứu gen-protein, rường ĐHY Hà Nội)