Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy

Sau khi nuôi cấy được tấm biểu mô kích thước 4 cm², tiến hành định danh tế bào của tấm biểu mô nuôi cấy bằng các kỹ thuật hiển vi quang học, hiển vi điện tử, hoá mô, hoá mô miễn dịch.

a. Nhuộm giemsa

Mục đích: quan sát bề mặt của tấm biểu mô nuôi cấy

- Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng nuôi cấy được trải phẳng lên lam kính.

- Cố định bằng cồn tuyệt đốitrong vòng 3 phút.

- Rửa lại bằng nước thường.

- Chuẩn bị giemsa 10% (Merck-Đức) pha trong nước cất ngay trước khi dùng.

- Nhuộm giemsa trong 10 phút.

- Rửa lam kính dưới vòi nước chảy.

- Để khô, dán lamella, sau đó kiểm tra trên kính.

b. Nhuộm Hematoxylin-Eosin

Mục đích: quan sát mặt cắt đứng của tấm biểu mô

- Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịch formol 10% trong 1-2 giờ

- Rửa nước trong 1-2 giờ

- Khử nước bằng cồn 70^o, 80^o, 90^o, 95^o, 100^o

- Làm trong miếng mô bằng cách ngâm lần lượt qua 3 lọ xylen - Ngấm nến ở tủ 60⁰ C trong vòng 2 giờ

- Đúc miếng mô trong khuôn nến - Cắt mẫu thành những lát mỏng 5-7µm

- Nhuộm màu theo phương pháp H.E. (Merck-Đức), quy trình như sau:

o Mẫu mô cắt lát mỏng 5-7µm được đưa lên lam kính

o Dàn đều mẫu mô bằng dung dịch Mayer, trên mặt phẳng ấm o Để tiêu bản khô trong tủ ấm 45⁰C trong vòng 2 ngày

o Chạy 3 lọ xylene để tẩy nến (10 phút 1 lọ) o Chạy 3 lọ cồn 90⁰ (10 phút 1 lọ)

o Rửa bằng nước cất

o Nhuộm Hemalun trong vòng 5 phút o Rửa dưới vòi nước lã trong 30 phút o Nhuộm Eosin trong vòng 5 phút o Rửa nước 10 giây

o Nhúng qua 2 cốc cồn 100 trong vòng 10 giây o Nhúng xylene nóng 56⁰C trong vòng 1 giờ o Dán lamella phủ mẫu vật

- Quan sát bằng kính hiển vi quang học.

c. Kỹ thuật hiển vi điện tử

Tấm biểu mô được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử xuyên (TEM).

Mục đích: quan sát cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô, tìm các cấu trúc liên kết giữa các tế bào biểu mô với nhau và giữa tế bào biểu mô với màng ối.

- Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịch glutaraldehyde 2,5% pha với đệm PBS trong 2 giờ.

- Rửa 3 lần trong 15 phút với PBS.

- Tiếp tục cố định trong 1giờ 30 phút bằng dung dịch osmium tetroxide 1%.

- Rửa lại miếng mô thêm 3 lần nữa bằng PBS.

- Chuyển qua cồn để khử nước (50⁰, 70⁰, 80⁰, 90⁰,95⁰, và 100⁰).

Với TEM, miếng mô sẽ được đúc trong khuôn nhựa epon, cắt lát siêu mỏng (300-400A^o). Những lát cắt này sẽ được đặt trên lưới đồng, và được nhuộm bằng uranyl acetate và citrate chì. Mẫu được đọc trên kính Jeol 1010.

Với SEM, miếng mô sẽ được chuyển qua dung dịch hexamethyldisilazane trong vòng 10 phút, sau đó để khô trong không khí. Khi đã khô, miếng mô được mạ phủ vàng, sau đó kiểm tra trên kính. (S-4800 – Hitachi).

d. Kỹ thuật hóa mô (nhuộm P.A.S.-Periodic acid-Schiff)

- Mục đích: Định tính và bán định lượng hydratcacbon, glycoprotein và mucin

- Một phần tấm biểu mô được cố định bằng dung dịch Carnoy và cắt thành những lát mỏng.

- Khử nến

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch acid periodic 1% trong vòng 15 phút - Rửa dưới vòi nước chảy trong vòng 5 phút

- Rửa lại bằng nước cất trong vòng 5 phút

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch Shiff trong vòng 30 phút để chỗ tối - Cho vào 2 cốc SO₂ đậy kín, mỗi cốc 2 phút

- Rửa nước thường 2-5 phút - Rửa nước cất

- Nhuộm nhân bằng Hematoxylin trong 3 phút - Ngâm nước thường 15 phút

- Nhúng cồn 100 nhanh - Ngâm xylene

- Gắn lamen

- Nhận định kết quả: sản phẩm dương tính trong phản ứng P.A.S. có màu tím đỏ.

e. Kỹ thuật hoá mô miễn dịch

Mục đích: để xác định một số loại keratin đặc hiệu có ở biểu mô NMM (trong đó K3 là loại keratin chỉ thấy ở các loại biểu mô tầng trong đó có NMM) và p63 là một loại protein nhân tế bào, đây là loại protein thấy xuất hiện nhiều ở các tế bào chưa biệt hóa.

- Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịch formol 10% trong 1-2 giờ

- Chạy nước để rửa sạch formol khoảng 1-2 giờ - Khử nước bằng cồn 70^o, 80^o, 90^o, 95^o, 100^o

- Làm trong miếng mô bằng cách ngâm lần lượt qua 3 lọ xylene - Đúc miếng mô trong khuôn nến

- Cắt mẫu thành những lát mỏng 5-7µm - Khử nến bằng xylene

- Khử xylene bằng cồn ethanol 100%, 95%, 75%

- Rửa mẫu 3 lần (5phút/lần) với PBST (phosphate buffered saline with tween) ở nhiệt độ phòng

- Bộc lộ kháng nguyên bằng nhiệt độ (96⁰C trong 30 phút) - Rửa lại 2 lần (5phút/lần) với PBST ở nhiệt độ phòng

- Để hạn chế việc gắn không đặc hiệu, mẫu được ủ với dung dịch chặn BSA 5% (bovine serum albumin) trong 1giờ ở nhiệt độ phòng

- Mẫu được ủ với kháng thể thứ nhất P63-L-CE nếu nhuộm p63, CK cocktail 1ml nếu nhuộm K3/K12 (Leica biosystems-Anh) ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ

- Rửa lại bằng PBS 3 lần (5phút/lần) - Chặn peroxidase

- Rửa lại 2 lần (5phút/lần) với PBST ở nhiệt độ phòng

- Mẫu tiếp tục được ủ với kháng thể thứ hai trong vòng 60 phút ở nhiệt độ phòng

- Rửa 3 lần với PBS

- Phát hiện sự gắn đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể bằng kit DAB (3, 3’-diaminobenzidine)

- Dán lamen

- Kiểm tra trên kính

- Nhận định kết quả: dương tính nếu

+ Bào tương của tế bào bắt màu nâu khi nhuộm K3/K12 + Nhân tế bào bắt màu nâu nếu nhuộm p63.