Chương 1: TỔNG QUAN
2.2. Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu
- Máy sắc ký khí – khối phổ: GC 7890A –MS 5975 của hãng Agilent. Cột sắc ký HP-5MS dài 30m, đường kính trong 0,25 mm, chiều dày film 0,25 µm (Agilent)
- Máy hóa sinh tự động Beckman Coulter 2700 dùng định lượng creatinine niệu và đo nồng độ các chất điện giải đồ trong huyết tương như natri, kali, clo theo nguyên lý sử dụng điện cực chọn lọc.
- Máy miễn dịch tự động Cobas e601 của hãng Roche dùng trong định lượng cortisol, ACTH, testosterone theo nguyên lý phản ứng miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA.
- Manifold để tách chiết ở pha lỏng của steroid niệu sau thủy phân.
- Máy lắc IKA vortex Genius 3.
- Máy trộn Roller-Mixer của DAIHAN Scientific.
- Máy Multivortex của THOMAS Scientific.
- Cân phân tích CPA3235 của SARTORIUS để cân hóa chất cần pha.
- Máy đo pH dung dịch ORION 3 STAR pH Benchop để đo pH dung dịch đệm acetat 2M dùng trong thủy phân steroid liên hợp trong nước tiểu.
- Tủ sấy Manheim của Đức dùng tạo dẫn xuất steroid ở 800C và 1100C.
- Thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ để loại bỏ methanol trong mẫu sau khi rửa giải loại Dry block heater của Ratek.
- Máy ly tâm, tủ lạnh 2-8oC, -20oC, pipette, tủ hút hóa chất.
- Các trang thiết bị cần thiết trong phòng xét nghiệm: găng tay, khẩu trang.
Hình 2.1. Hệ thống sắc ký khí – khối phổ Agilent
Đây là hình ảnh hệ thống GC/MS tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương là thiết bị quan trọng để thực hiện nghiên cứu này.
2.2.2. Hoá chất và vật tư tiêu hao
Hóa chất định lượng steroid niệu gồm:
- Chất chuẩn steroid niệu (Standard steroid urine) dạng đông khô của SKML (Hà Lan), chứa nồng độ xác định các steroid cần định lượng như An, Et, DHEA, 11keto An, 11OH An, 11OH Et, PD, PT, A’3, THE, THF, 5a-THF, α-cortolone, β-cortolone, α-cortol, β-cortol. Chuẩn steroid được làm mỗi khi định lượng steroid nhằm xây dựng đường chuẩn để tính nồng độ steroid niệu trong mẫu thử.
- Steroid tinh khiết (pure steroid của Steraloids/Sigma): các steroid tinh khiết
> 99% được sử dụng để xác định thời gian lưu, mảnh ion đặc hiệu nhằm xác định tương ứng trong mẫu thử nghiên cứu các steroid niệu. Các steroid tinh khiết được sử dụng: An, Et, DHEA, 11-OH An, PD, PT, THE, THF, 5α-THF.
- Chuẩn nội Androstanol (5α-ANDROSTAN-3β-OL) của IsoSciences, dạng đông khô, lọ 100mg, (mã hóa chất 14283). Sau khi pha với methanol, chuẩn nội được cho vào mỗi mẫu thử một lượng như nhau để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình xét nghiệm.
- Acid acetic bình dung tích 2,5L của Merck loại đậm đặc 100% dùng để pha dung dịch đệm acetat 2M (mã số hóa chất 1.00063.2500).
- HCl (hydrochloric acid fuming 37%) của hãng Merck- sản xuất tại Đức.
Hóa chất dạng dung dịch, chai 1L, (mã hóa chất 1.00317.1000).
- Methanol dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức, (mã hóa chất 10909809 742). Dùng để hoạt hóa cột Bond Elut, rửa giải và pha chuẩn nội, steroid tinh khiết.
- Enzym β-Glucuronidase/arylsulphatase của hãng KURA loại dung dịch 10mL hoặc 25mL để thủy phân steroid liên hợp.
- Nitrogen có độ tinh khiết rất cao, mã số UN 1066, nồng độ ≥99,999%
dùng làm khô sản phẩm steroid sau tách chiết.
- Helium có độ tinh khiết cao, mã số UN 1046 dùng để sắc ký khí.
- Methoxyamine hydrochloride độ tinh khiết 98%, lọ 5G dạng bột của hãng Sigma Aldrich, (mã 101397955) dùng để tạo dẫn xuất với steroid.
- Pyridine dạng dung dịch chai 1L của hãng Sigma Aldrich có độ tinh khiết
≥99,5% (mã hóa chất 33553), sử dụng để pha methoxyamine.
- Sodium acetate anhydrous dạng bột, loại 1000G của Merck dùng để pha đệm acetat 2M trong quá trình thủy phân steroid liên hợp.
- Sodium -L-ascorbate (vitamin C), (mã hóa chất A4034), lọ 100G dạng bột của hãng Sigma Aldrich có độ tinh sạch ≥98% nhằm ổn định các steroid tự do.
- Iso-octan dạng dung dịch 1L của hãng Sigma Aldrich dùng để tách chiết steroid sau khi đã thủy phân và tạo dẫn xuất.
- TMSI (n-Trimethylsilylimidazole) dạng dung dịch, lọ 25mL của SUPELCO, sản xuất tại Hoa Kỳ, (mã hóa chất 33068U).
- Nước cất tinh khiết dành cho sắc ký: dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức dùng để pha hóa chất, chất chuẩn...
Vật tư tiêu hao bao gồm: Lọ thủy tinh 2 mL có nắp, ống nghiệm thủy tinh chịu nhiệt loại 7mL và 10mL của Kimax hoặc Pirex.
Cột Bond-Elut C18 dùng để tách chiết, tinh sạch các steroid tự do.
Bảng 2.1: Các sản phẩm steroid niệu được định lượng
Steroid niệu Thời gian lưu (phút)
Ion đích (m/z)
Ion định lượng (m/z)
Chuẩn nội 13,3 243 258
An 16,9 270 360
Et 17,1 270 360
DHEA 18,2 268 358
11 keto An 18,7 300 315
11-OH An 19,6 448 358
11-OH Et 19,8 448 358
PD 20,4 269 284
PT 20,8 435 255
A’3 21,4 432 329
THE 23,4 578 488
THF 23,9 562 472
5α-THF 24,1 562 472
α-Cortolone 24,4 449 359
β-Cortol 24,5 343 243
β-Cortolone 24,8 449 359
α-Cortol 25,1 343 243
THS* 21,8 474 564
THS là steroid có trong mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để bán định lượng THS trong mẫu thử do mẫu chuẩn không có nồng độ cho THS.
2.2.3. Chất liệu nghiên cứu
- Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khỏe mạnh và người bệnh nghi mắc TSTTBS, RLPTGT. Yêu cầu của mẫu nước tiểu:
Không sử dụng chất bảo quản.
Thể tích cần thiết > 3mL nước tiểu.
Bảo quản: mẫu nước tiểu sau khi lấy được bảo quản tạm thời ở 2 - 8oC tối đa được 2 tuần. Bảo quản ở -20oC đến khi phân tích (tối đa được 6 tháng).
Thời gian thu thập mẫu: 10/2015-7/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu