*Liên hệ: chaonguyenvan27@gmail.com
Nhận bài: 15-03-2016; Hoàn thành phản biện: 28-06-2016; Ngày nhận đăng: 15-10-2016
ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN HAEMOPHYLUS PARASUIS VÀ TIỀM NĂNG SẢN XUẤT VACCINE PHÒNG BỆNH
Nguyễn Văn Chào1,2*, Vũ Thị Thanh Tâm3
1Trường Đại học Nông nghiệp Hoa Trung, Thành phố Vũ Hán, Trung Quốc
2Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế
3Viên nghiên cứu khoa học Miền Trung, Thành phố Huế, Thừa Thiên Huế
Tóm tắt: Haemophylus parasuis (H. parasuis) là vi khuẩn thuộc họ Pasteurallaceae, được biết đến là nguyên nhân gây bệnh Glasser trên lợn. Vi khuẩn gây bệnh với những triệu chứng khá trầm trọng như viêm đường hô hấp, viêm màng não, viêm đa khớp. Tuy nhiên, những nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn này ở Việt Nam còn rất hạn chế. Các nghiên cứu đã công bố trên thế giới về H. parasuis thường quan tâm đến: phương thức gây bệnh, khả năng xâm nhập vào cơ thể, cơ chế sản sinh các yếu tố gây bệnh, sự khác nhau giữa các chủng có độc lực cao và các chủng độc lực thấp. Dựa trên việc thu thập các kết quả nghiên cứu liên quan đến vi khuẩn H. parasuis đã được công bố trên các tạp chí có uy tín. Bài báo sử dụng các dẫn liệu để phân tích đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh của H. Parasuis, các yếu tố là độc tố như lipooligosaccharide, thành phần nha bào, protein màng, các yếu tố tham gia vận chuyển tự động. Đồng thời, bài báo cũng tóm tắt các kết quả nghiên cứu về một số độc tố có thể sử dụng làm vaccine phòng bệnh. Từ những kết quả đó chỉ ra những ứng dụng trong phòng bệnh do H. parauis gây nên.
Từ khóa: Độc tố, độc lực, H. parasuis, vaccine.
1 Đặt vấn đề
H. parasuis được biết đến từ lâu bởi là vi khuẩn khu trú thường xuyên ở đường hô hấp trên của lợn. Tuy nhiên, nó có thể gây bệnh toàn thân, là nguyên nhân gây nên bệnh Glasser với các triệu chứng sinh tơ huyết, viêm đa khớp và viêm màng não [33]. Vi khuẩn thường gây bệnh ở đường hô hấp trên của lợn, nhưng trong một số trường hợp vi khuẩn có thể xâm nhập và gây viêm phổi, sau đó lan sang các cơ quan khác. Trước đây bệnh thường ít xảy ra, tuy nhiên trong thời gian gần đây do sự phát triển của nhiều nguy cơ gây suy giảm hệ thống miễn dịch đã làm gia tăng số ca mắc bệnh [1]. Các trang trại không đảm bảo vệ sinh sẽ làm gia tăng tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong [5]. Đến nay, đã có 15 type huyết thanh của H. parasuis được nghiên cứu [48]. Một số thí nghiệm gây bệnh và số liệu dịch tễ học cho thấy các serotypes 1, 5 và 12-14 là những serotypes có độc lực cao nhất, nhưng vẫn chưa có những nghiên cứu toàn diện về sự liên quan giữa serotype với cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn, cũng như chỉ thị đặc hiệu để chẩn đoán chính xác các chủng độc lực cao của H. parasuis [21]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng H. parasuis mang nhiều loại độc tố khác nhau. Bởi vậy, nghiên cứu đặc điểm các loại độc tố có vai trò quan trọng trong mục tiêu chẩn đoán và kiểm soát bệnh do H. parasuis gây ra. Xác định các yếu tố độc lực còn giúp phân biệt giữa các dòng và tiến tới hoàn thiện các loại vaccine phòng bệnh có hiệu quả.
2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1 Nội dung nghiên cứu
Đặc điểm sinh học, các yếu tố là độc tố và cơ chế gây bệnh trên lợn của vi khuẩn H.
Parasuis.
Tiềm năng sử dụng các yếu tố là độc tố để sản xuất vaccine phòng bệnh do vi khuẩn H.
Parasuis gây ra.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Các bài báo được sưu tầm từ nhiều nguồn khác nhau và liệt kê thành các kết quả được trình bày dưới dạng phân tích hợp logic cho từng nội dung. Các kết quả nghiên cứu về vi khuẩn H. parasuis trong mỗi bài báo được sử dụng làm căn cứ để phân tích cho các nội dung đã được nêu. Từ việc phân tích các kết quả nghiên cứu nhằm rút ra được một số nhận xét đánh giá về mức độ gây bệnh của từng yếu tố là độc tố của vi khuẩn. Những kết quả nghiên cứu về thử nghiệm vaccine cũng được phân tích để phục vụ cho việc đưa ra một số đánh giá về khả năng phòng bệnh.
3 Kết quả nghiên cứu
3.1 Đặc điểm sinh học của H. parasuis
H. parasuis là vi khuẩn Gram âm, không di động, thuộc chi Haemophilus, họ Pasteurellaceae [2]. Chúng không có cấu trúc cố định có thể từ dạng hình que đến dạng hình sợi. Một số chủng H. parasuis có cấu trúc của nha bào là các chuỗi polysaccharidic [28]. Nha bào của các chủng H. parasuis giống với coccobacilli khi xem dưới kính hiển vi, nhưng chúng có thể có diềm và có cấu trúc dạng sợi, nếu được phân lập trên môi trường chorio-alantoid màng phôi gà [30]. Một số môi trường được sử dụng để phân lập vi khuẩn H. Parasuis bao gồm chocolate agar, Levinthal agar, PPLO agar và TSA có bổ sung 5 % NAD [16]. H. parasuis phát triển trên môi trường thạch máu không làm tan huyết cầu, phản ứng urease và oxidase âm tính, catalase dương tính, sản sinh nitrates, không sinh indol lên men các loại đường glucose, galactose, mannose, fructose, saccharose và maltose [22].
Nhiều nghiên cứu cơ bản đã mô tả type huyết thanh để phân biệt giữa các chủng của H.
parasuis. Trên cơ sở phản ứng ngưng kết nhanh, Bakos et al., (1952) đã phân biệt được 4 chủng H. parasuis được ký hiệu từ A-D. Sau đó Morozumi và Nicolet (1986) đã xác định được 7 type (1-7), Kielstein et al., (1991) phát hiện thêm 6 serotyp (Jena 6-Jena12) và Kielstein và Rapp- Gabrielson (1992) cũng xác định 5 serotype (ND1-ND5). Trên cơ sở phản ứng miễn dịch học với mức đặc hiệu cao hơn thì Kielstein và Rapp-Gabrielson (1992) đề nghị phân loại các serotype của H. parasuis theo cách mới và được chấp nhận đến nay, đó là phân thành 15 serotpye (1-15).
3.2 Các độc tố của vi khuẩn H. parasuis
Một số yếu tố độc lực của H. parasuis đã được xác định thông qua việc giải trình tự gene và nghiên cứu phiên mã. Không chỉ dừng lại ở các nghiên cứu biểu hiện gene mà các nghiên cứu còn được thực hiện trên động vật hoặc so sánh các chủng có độc lực khác nhau. Sử dụng các cách biểu hiện khác nhau của kỹ thuật RT-PCR mà các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy được 7 gene quy định cho khả năng đáp ứng với stress nhiệt [13], trong đó có acyl-CoA synthetase (fadD), diadenosine tetraphosphatase (apaH), enzyme I của phosphoenolpyruvate protein phosphotrans-ferase system (pstI) và cysteine synthetase (cysK).
Một số cấu trúc gene khác nhau đã được xác định ở các chủng có độc lực khác nhau của H. parasuis, bao gồm sự khác nhau về khả năng dung giải hồng cầu (hhdBA), gene quy định cho tính trạng hấp thu sắt (cirA, tbpA/B và fhuA) và gene quy định yếu tố bám dính. Tuy nhiên, vai trò gây độc (độc tố) của các yếu tố này vẫn chưa được chứng minh thấu đáo [49]. Các gene quy định tính trạng tham gia qua trình trao đổi chất, chống stress, protein bề mặt, điều hòa phiên mã trong quá trình gây nhiễm ở phổi, bao gồm cả gene dung giải hồng cầu đều được coi là các yếu tố độc lực. Thêm vào đó là các gene quy định cho các yếu tố bám dính.(vtaA), siaB và khả năng dung giải protein cũng được coi là độc tố của H. parasuis [17].
Ở cấp độ protein, khi điện di protein ngoài màng của H. parasuis (phân lập từ lợn bệnh và lợn khỏe mạnh) trong gel có nồng độ dodecyl sulphate–polyacrylamide khác nhau đều thấy các loại độc tố phổ biến [43]. Phương pháp miễn dịch học đã được sử dụng để xác định các kháng nguyên của H. parasuis, bao gồm OmpP2, PalA, D15 và HPS 06257; trong đó vai trò gây độc của OmpP2 đã được nghiên cứu, còn những protein khác hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu [56].
Cấu trúc của nha bào
Nha bào của hai chủng H. parasuis (serotype 5 và 15) đã được Perry et al. (2013) nghiên cứu; cấu trúc của nó gồm một chuỗi disaccharide với sự lặp lại của các đơn vị β-glucosed-6P và 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxy-D-galactopyranose, có sự thay thế với α-Neu5R-3-a-GalNAc-1-P ở serotype 15 hoặc α-Neu5R-3-a-Gal-1-P ở serotype 5, trong đó R có thể là nhóm N-acetyl hoặc nhóm N-glycolyl. Glycolyl-neuraminic acid trước đây chỉ tìm thấy trên người, nhưng đây là lần đầu tiên được mô tả trên vi khuẩn. Những điểm khác nhau ở polysaccharide có thể dựa vào để đánh giá sự khác nhau giữa các serotype khác nhau của H. parasuis, nhưng lại không có sự khác nhau giữa các bán polysaccharide của LOS [40]. Sự hình thành nha bào không thực sự có liên quan đến độc tố của H. parasuis [42]. Các chủng có độc lực cao thường hình thành nha bào sau tiếp xúc với các đại thực bào ở phế nang, điều này cho thấy vai trò của nha bào là để chống lại sự thực bào [34]. Gene capD liên quan đến quá trình hình thành nha bào, nó đã được phát hiện trên chủng độc lực cao Nagasaki của H. parasuis, nhưng lại không được phát hiện trên chủng độc lực thấp SW114 [55]. Gene capD cũng đã được tìm thấy trên một biến chủng của chủng độc lực cao H. parasuis SH0165 nhưng nó không có khả năng gây bệnh và cũng không có tính kháng nguyên [49]. Những gene khác liên quan đến sự tổng hợp polysaccharide (galU và gale) chỉ có vai trò trong quá trình hình thành màng tế bào chất và tính kháng nguyên [59]. Tuy
nhiên, nghiên cứu đánh giá mối liên hệ giữa các gene này với quá trình hình thành nha bào cần được nghiên cứu làm rõ.
Lipooligosaccharide
H. parasuis có một lipopolysaccharide (LPS) mạch ngắn, do thiếu một đơn vi lặp lại của O- tiểu đơn vị hình thành kháng nguyên, do đó, phân tử này được coi như là một lipooligosaccharide (LOS) [31]. LOS của H. parasuis có chức năng giống như các yếu tố gây hoại tử (TNF)-a và IL-6 được sản xuất từ dòng tế bào RAW 264.7 giống LPS của Escherichia coli, Actinobacillus pleuropneumoniae và Pasteurella multocida [31]. Bouchet et al., (2009) đã chứng minh một phần vai trò của LOS (chiết từ vi khuẩn H. parasuis chủng Nagasaki) đối với khả năng bám dính, xâm nhiễm và sản xuất yếu tố gây viêm. LOS của H. parasuis có thể kích thích tế bào biểu mô của vi mao quản trên mô thần kinh của lợn (PBMEC) và tế bào khí quản của lợn con (NPTr) sản sinh IL-8 và IL-6. Tuy nhiên, khả năng bám dính của H. parasuis lên các tế bào (PBMEC) và (NPTr) bị loại bỏ hoàn toàn do bị LOS cạnh tranh, điều này cho thấy rằng còn có yếu tố bám dính khác. Một nghiên cứu vai trò heptoses của LOS đã được tiến hành. Nghiên cứu đã chứng minh rằng một LOS hoàn thiện có những đặc tính quan trọng: tính kháng huyết thanh, tính bám dính và xâm nhiễm, trong khi đó nếu loại bỏ heptose III chỉ làm ảnh hưởng đến tính kháng huyết thanh của LOS [50]. Ngoài ra, một kháng thể đơn dòng chống lại LOS giúp bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại khả năng gây bệnh của H. parasuis [46].
Tác dụng của acide sialic làm biến đổi LPS có liên quan đến độc lực của H. parasuis, đặc biệt là tính kháng huyết thanh của các vi khuẩn thuộc họ Pasteurellaceae, bao gồm Haemophilus influenzae và Histophilus somni [15]. Những vi khuẩn có enzyme neuraminidases có thể sử dụng acide sialic (N-acetylneuraminic acid hoặc Neu5Ac) của vật chủ.
Acide sialic là một yếu tố nội sinh, có thể được sử dụng như nguồn carbon hoặc nitơ hoặc có thể bị biến đổi bởi CMP-Neu5Ac synthetases (như là NeuA và SiaB) kết hợp với LOS bởi sialytransferase LsgB [45].
Một enzyme neuraminidase đã được xác định và chiết xuất từ màng ngoài của H.
parasuis [24]. Sự hiện diện của gene nanH (neuraminidase) và neuraminidase hoạt hóa là rất phổ biến ở H. parasuis và không liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng của các chủng gây bệnh [25]. Ngược lại, LsgB là biểu hiện rất phổ biến ở các chủng H. parasuis phân lập từ nội tạng và không phổ biến với chủng được phân lập từ mũi. Tính kháng huyết thanh có liên quan đến khả năng kết hợp giữa acide sialic với LOS ở mức độ phân tử của H. parasuis [25]. Từ những nghiên cứu trên, cùng với việc làm giảm tính kháng nguyên bằng cách loại bỏ gene quy định cho heptose III [50], cho phù hợp với khả năng kết hợp với acide sialic của LOS dựa trên liên kết với đường của heptose III, giống như tính liên kết với acide sialic của LOS [14]. Ngoài ra, sử dụng độc tố IsgB+ của chủng đối chiếu Nagasaki, acide sialic là điển hình của LOS trên H.
parasuis [25]. Vai trò của acide sialic giúp H. parasuis gây bệnh cũng đã được chứng mình bởi Jin et al. (2008) [17], đã báo cáo có sự sao chép của siaB/neuA trong quá trình lây nhiễm.
Các CDT (Cytolethal distending toxin)
CDT nằm trong họ độc tố type-AB2 của vi khuẩn, chúng thường bao gồm các tiểu đơn vị CdtA, CdtB và CdtC, trong đó CdtB là đơn vị hoạt hóa độc tố, CdtA và CdtC là những yếu tố cần thiết để CDT tấn công và phát tán CdtB vào tế bào [19]. Gene quy định cho CDT đã được tìm thấy ở rất nhiều vi khuẩn Gram âm gây bệnh [19]. CdtB là một DNAse và là yếu tố cần thiết cho CDT trung gian bắt giữ tế bào ở pha G2/M và kết quả cuối cùng là gây chết đối với một số loại tế bào của động vật có vú [9].
Ở vi khuẩn H. parasuis hai gene quy định cho CDT nằm trên cùng một locus đã được xác định và trên chủng SH0165 chúng đã được giải trình tự [57]. Quá trình tái tổ hợp protein cho thấy các độc tố này hoạt động và làm ngưng trệ chu trình tế bào tách biệt. CdtB protein biểu hiện với 109 đặc tính và ở tất cả 15 chủng H. parasuis, không phụ thuộc độc lực của vi khuẩn [57]. Zhang et al. (2012) đã sử dụng biến thể CDT không hoàn thiện của H. parasuis từ tự nhiên chuyển cho chủng SC096 gây bệnh. Kết quả là những biến thể này đã làm tính nhạy cảm huyết thanh và giảm tính bán dính và tính xâm nhiễm đối với tế bào màng mao mạch và tế bào biểu mô thận lợn.
6-Phosphogluconate dehydrogenase
Đặc trưng của 6-Phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) thành phần cấu trúc vách tế bào của H. parasuis đã được xác định như là một yếu tố kháng nguyên bảo vệ Streptococcus suis trong quá trình gây bệnh trên lợn [11]. Protein này xuất hiện, có vai trò như yếu tố bám dính giúp vi khuẩn gắn lên bề mặt biểu mô đường hô hấp của vật chủ. Khi protein 6PGD được tái tổ hợp thể hiện khả năng bám dính của H. parasuis lên tế bào biểu mô đường hô hấp [11].
Thêm vào đó quá trình tái tổ hợp 6PGD giúp tế bào tăng sản xuất các IL-8 và IL-6. Đáp ứng miễn dịch và tính bảo hộ trên chuột cũng đã được làm sáng tỏ, điều này cho thấy nó có khả năng đóng vai trò như kháng nguyên có thể dàng làm vaccine [44].
Nhóm protein màng
Protein màng tham gia vào cấu trúc kênh băng qua màng của các vi khuẩn gram âm [12].
Có hai protein màng OmP2 và OmP5 đã được phát hiện ở H. parasuis. OmP2 là một trong những protein nhiều nhất trên màng tế bào H. parasuis [56], chuỗi OmP2 của các chủng vi khuẩn không độc thường xuyên có những vị trí bị chèn vào, bao gồm một cấu trúc dạng cuộn chèn vào tại vị trí protein tiếp theo [23]. Khi loại bỏ một đột biến của H. parasuis chủng SC096 đồng thời làm mất OmP2 đã làm tăng tính kháng nguyên của vi khuẩn này [51], khi tính kháng nguyên tăng lên làm tăng gấp đôi khả năng bắt giữ của kháng thể IgG và theo đó làm tăng khả năng hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển [58]. OmP2 cũng đã làm tăng khả năng bám dính lên một dòng tế bào đại thực bào ở phế nang của lợn [52] và làm giảm khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào biểu mô và tế bào nội mô [53]. Tuy nhiên, OmP2 bị đột biến đã cho thấy khả năng phát triển khiếm khuyết, thêm vào đó là sự thay đổi cấu trúc của OMP. Một số protein khác, ThyA, RfaD và Mip là biểu hiện khác trên cơ sở OmP2 đột biến và bộc lộ khả năng bám dính, điều này giải thích rằng các OmP2 đột biến có khả năng bị bắt giữ cao hơn [53]. Một Omp5 tương tự của H. influenza, được ký hiệu P5 (OmPA), đã được chiết xuất từ H. parasuis
bởi McVicker và Tabatabai (2006) [27]. Protein OmP5 của H. parasuis có 4 vùng nhạy cảm mã hóa cho 4 protein dạng vòng nằm trên bề mặt tế bào, nó có thể thay đổi giữa các chủng [47].
Pina-Pedrero et al. (2012) đã xác định được 6 vùng vận chuyển tự động (Bma/AT-1) của H. parasuis bằng cách phân tích so sánh hệ gene, trên các locus mã hóa cho AT-1 và các gene kề cận từ ba chủng H. parasuis serotype 5. Trong điều kiện in vivo tính kháng nguyên của các vùng vận chuyển được tái tổ hợp gồm bmaA1, bmaA4, bmaA5, bmaA6 đã được chứng minh.
Ngoài ra, các vùng vận chuyển khác bmaA2 và bmaA3 được cho là vùng câm trên một trong ba chủng H. parasuis nghiên cứu. ESP (extracellular serine protease) ngoại bào phù hợp với BmaA5/6, nó biểu hiện trong quá trình gây bệnh trên lợn. Thành phần bảo vệ chống lại H.
parasuis đã được mô tả trên chuột lang sau khi tiêm vaccine tái tổ hợp của EspP [54]. Vai trò của EspP đã không được xác định, nhưng nó có thể tương thích với việc hoạt hóa enzyme IgA protease [29].
Gene quy định cho VtaA (Virulence associated trimeric autotransporters) được tạo thành từ một tập hợp đa gene nó liên quan đến khoảng 10 lần lặp lại trên mỗi gene nôm của vi khuẩn H. parasuis, được phân biệt thành 3 nhóm nhỏ hơn (nhóm 1, 2 và 3) bằng các chuỗi lặp lại giống nhau trên các vùng vận chuyển [41]. Những gene vtaA mã hóa cho những protein ngoài màng với đặc tính bám dính trên từng vùng. Kháng nguyên của chuột biểu hiện phản ứng chéo với các vtaA trong cùng một nhóm [35]. Từ đó một vài bản sao của vtaA đã được tìm ra, điều này đã cho thấy chiến lược tránh khỏi hệ thống miễn dịch bằng ngăn cản khả năng nhận diện kháng nguyên của H. parasuis. Với nhóm 3 vtaA có tính bảo tồn rất cao ở H. parasuis, trong khi nhóm 1 và nhóm 2 vtaA được tìm thấy chủ yếu ở các chủng độc lực cao. Sự khác nhau về biểu hiện của vtaA đã được sử dụng để xác định độc tố bằng kỹ thuật PCR [36].
Tính kháng nguyên của VtaA đã được thí nghiệm bằng cách sử dụng kháng thể lấy từ lợn sữa đã được công cường độc bằng liều gây chết tối thiểu chủng Nagasaki [38]. Các vtaA1, 5, 6, 8, 9 và 10 (từ nhóm 1 và 2) có tính khích thích sinh kháng thể và biểu hiện tốt trong điều kiện in vivo, những biểu hiện kém trong khi phát triển trong điều kiện in vitro. Hỗn hợp 6 vùng có tính sinh kháng thể của vtaA1, 5, 6, 8, 9 và 10 bảo vệ chống lại một liều công cường độc của chủng Nagasaki [37]. Hai thành phần của hệ vận chuyển tự động từ nhóm 1 (VtaA8 và VtaA9) là những protein biểu lộ trên bề mặt có liên quan đến khả năng kháng lại sự thực bào, nhưng nó đã không phải là yếu tố ức chế hoàn toàn quá trình thực bào bởi các đại thực bào. Kháng thể đơn dòng chống lại VtaA8 và VtaA9 là có thể bắt giữ độc tố của các chủng khác và trình diện cho các tế bào thực bào đã hoạt hóa [7].
Sinh bệnh học của vi khuẩn H. parasuis
Sinh bệnh học của H. parasuis là một quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều yếu tố, cùng với đó là những cơ chế phức tạp để thiết lập sự lây nhiễm và gây bệnh. Quá trình gây bệnh bao gồm sự tấn công vào tế bào vật chủ lẩn tránh sự phòng vệ của cơ thể, nhân lên nhanh chóng và gây hại đến mô xung quanh. So sánh chủng độc lực cao và chủng độc lực thấp của H.
parasuis trong các thí nghiệm cho phép xác định một số cơ chế gây bệnh. H. parasuis bắt đầu quá trình gây bệnh bằng cách bám dính và xâm nhập qua các tế bào biểu mô, lẩn tránh hệ thống miễn dịch bằng cách làm thoái hóa chức năng của IgA [10], kháng lại hệ thống thực bào và hệ thống bổ thể [34]. Sau khi xâm nhập vào trong tế bào, gia tăng số lượng, sản xuất các chất kích
thích phản ứng viêm và gây lên những triệu chứng của bệnh Glasser. Tính thấm của màng tế bào thay đổi do tác dụng của các yếu tố gây viêm sau đó lan tràn khặp nội bào, đây là bước phát triển quan trọng dẫn đến viêm màng não [4]. Trong điều kiện in vitro các chủng H.
parasuis độc lực cao có khả năng sinh màng nhầy đặc hiệu hơn các chủng có độc lực thấp được phân lập từ mũi [18]. Tuy nhiên, biểu hiện của các gene tương đồng với chức năng sinh màng nhầy (siaB, htrA, fumC, gcpE and acrR) đã được xác định trong quá trình gây nhiễm ở phổi [17]. Yếu tố bám dinh và xâm nhập qua màng tế bào đã được mô tả trên các chủng H. parasuis độc lực cao và có thể là yếu tố quan trọng trong bước đầu tiên của quá trình gây nhiễm H.
parasuis có thể gây chết tế bào bằng cách làm thay đổi cấu trúc màng, nó có thể làm trương phồng và gây vỡ màng tế bào chất [3].
Trong phổi các chủng độc lực thấp có thể bị loại bỏ bởi các tế bào thực bào. Ngược lại các chủng có độc lực cao lại có thể tránh được các tế bào thực bào ở phế nang, do chúng có khả năng hình thành nha bào. Trong trường hợp có sự hiện diện của kháng thể chúng không hình thành được nha bào thì có thể dễ dàng bị hệ thống thực bào tiêu diệt [34]. Ảnh hưởng nitric oxide đối với quá trình gây bệnh của H. parasuis vẫn chưa được rõ ràng. Mặc dù các tế bào thực bào sản sinh các nitric oxide synthase (iNOS) ở mức độ thấp [39]. Điều này cho thấy vì sao H. Parasuis không có khả năng kích thích và kém hấp dẫn đối với các tế bào thực bào ở phổi. Vì vậy, cần chú ý đến khả năng sản xuất nitric oxide synthase (iNOS) kém ở các tế bào thực bào của lợn [20]. Các chủng có độc lực cao sẽ làm chậm quá trình hoạt hóa đại thực bào ở phế nang giúp cho vi khuẩn có thể bám dính và nhân lên nhanh chóng ở phổi. Sau đó với khả năng hoạt hóa mạnh các đại thực bào sản xuất tiền tố kích thích gây viêm, tiếp theo là quá trình sinh bệnh [8]. Mặc dù, cơ chế của quá trình sinh bệnh trong máu chưa được chứng minh, nhưng khả năng xâm nhập qua màng tế bào chất thể hiện ở các chủng độc lực cao có thể đóng vai trò quan trọng đối với quá trình nhiễm trùng huyết [1]. H. parasuis có độc lực cao khi xâm nhập vào máu có thể tránh được sự tiêu diệt của hệ thống bổ thể [6]. H. parasuis có thể lẩn tránh tác dụng của kháng thể, vì vậy vi khuẩn có thể lây lan rộng rãi sang các tổ chức khác, đó cũng là nguyên nhân của hiện tượng viêm phúc mạc và viêm đa khớp. Sự hình thành nha bào có thể để chống lại tác dụng của kháng thể, trong quá trình thí nghiệm đã quan sát thấy nha bào của vi khuẩn làm cho hệ thống bổ thể không còn tác dụng [34]. Sự xâm nhập qua màng tế bào chất của các chủng H. parasuis có độc lực cao, giải thích cho việc các chúng có thể băng qua hàng rào mãu não và gây viêm màng não. Khả năng gây chết tế bào của vi khuẩn H. parasuis có liên quan đến các Interleukin (IL)-6 và IL-8 có ở biểu mô và màng trong của tế bào [3]. Các cytokine có vai trò rõ ràng trong việc hình thành yếu tố kích thích gây viêm và phát triển bệnh tích của bệnh Glässer.
Tiềm năng sử dụng các loại độc tố để sản xuất vaccine
Hiện nay đã có một số loại vaccine được sử dụng để phòng bệnh do H. parasuis gây ra.
Tuy nhiên, hiệu quả của các loại vaccine nay còn nhiều hạn chế. Đa số các loại vaccine được sản xuất dựa vào các loại độc tố của vi khuẩn này và một số khác dựa vào việc sử dụng tế bào chết của các serotype khác nhau. Bak và Riising (2002) đã thử nghiệm một loại vaccine chứa H.
parasuis serotype 5 được làm yếu. Kết quả cho thấy loại vaccine này có thể bảo vệ lợn thí nghiệm chống lại vi khuẩn H. parasuis 2 tuần sau tiêm. Martín de la Fuente et al., (2009) đã sử
dụng 3 loại vaccine có chứa các thành phần khác nhau từ vi khuẩn H. parasuis. Trong đó một loại dùng các serotype 2, 4 và 5 của H. parasuis đã được vô hoạt; một loại dùng protein màng (OMP) của H. parasuis kết hợp với TbpB đã được làm giàu trong điều kiện thiếu sắt; một loại khác chỉ dùng TbpB từ chủng Nagasaki được dòng hóa qua Escherichia coli. Kết quả cho thấy các vaccine bất hoạt và vaccine được sử dụng protein màng kết hợp với TbpB có thể bảo vệ lợn thí nghiệm chống lại liều gây chết tối thiểu (5x109CFU/ml, tiêm 2ml/con) của vi khuẩn H.
parasuis. Ngược lại loại vaccine có chứa TbpB được dòng hóa không thể bảo vệ động vật thí nghiệm do có sự xuất hiện các triệu chứng trầm trọng của bệnh. Sử dụng một loại vaccine đã được thương mãi hóa có chứa serotype 4 và 5 của vi khuẩn H. parasuis tiêm cho lợn nái giai đoạn mang thai và tiêm cho lợn con sau khi sinh. Kết quả cho thấy khả năng phân lập được vi khuẩn H. parasuis ở nhóm không được tiêm vaccine cao hơn ở nhóm được tiêm vaccine. Ngoài ra, các chỉ số hàm lượng kháng thế IgG, số lượng tế bào lympho, khả năng sản sinh -interferon của tế bào ở nhóm được tiêm vaccine cao hơn nhiều so với nhóm không được tiêm vaccine [32].
Frandoloso et al., (2011) đã phát triển 4 loại vaccine: 1) sử dụng NPAPT (native outer membrane proteins with affinity to porcine transferring) của H. parasuis serotyp 5, chủng Nagasaki pha trong dầu; 2) Cũng protein trên nhưng được xử lý với enzyme neuraminidase từ vi khuẩn Clostridium perfringens; và hai loại khác từ protein tái tổ hợp (transferrin-binding protein rTbp A hoặc B) là một phần cấu trúc của H. parasuis chủng Nagasaki [26]. Lô đối chứng dương sử dụng một loại vaccine đã được thương mại hóa; lô đối chứng âm không được tiêm vaccine. Lợn được tiêm vaccine vào thời điểm 28 và 49 ngày sau đó đến 63 ngày tuổi tất cả lợn thí nghiệm được công cường độc với liều gây chết (3x108CFU/ml; 2ml/con) vi khuẩn H.
parasuis chủng Nagasaki. Kết quả là hai loại vaccine chứa rTbp có kết quả tương tự nhau về khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh và các dấu hiệu khác (triệu chứng lâm sàng, thể trạng và bệnh tích đại thể, vi thể). Trong khi đó hai loại vaccine có kháng nguyên NPAPT giúp lợn thí nghiệm có khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh (không biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh, không phân lập được vi khuẩn H. parasuis từ mẫu mổ khám. Kết quả nghiên cứu của Zhang et al., (2012) cho thấy extracellular serine protease-like protein (ESP-like protein) là một trong đối tượng có thể sử dụng làm vaccine để phòng bệnh do H. parasuis gây ra.
Kết luận
Các chủng H. parasuis độc lực cao muốn gây bệnh cần có sự kết hợp của các loại độc tố, giúp chúng có thể lây lan và nhân lên trên niêm mạc đường hô hấp. Tuy nhiên, rất nhiều loại độc tố vẫn chưa được nghiên cứu hoặc chưa được giải thích cơ chế. Xác định các yếu tố cần thiết để gây bệnh, đáp ứng của hệ thống miễn dịch đối với từng loại độc tố sẽ giúp hiểu thêm về khả năng gây bệnh của H. parasuis cuối cùng để sản xuất vaccine phòng bệnh. Ngoài ra, xác định các độc tố của H. parauis có thể nâng cao kỹ thuật chẩn đoán bằng cách so sánh giữa các chủng có độc lực khác nhau. Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra chức năng đặc hiệu của các protein là độc tố của H. parasuis. Đặc biệt, vai trò của các polysaccharides cần được tìm hiểu sâu hơn để đánh giá vai trò của nha bào, màng nguyên sinh trong quá trình gây bệnh của H. parauis. Một số loại vaccine cũng đã được sản xuất thử nghiệm. Tuy nhiên hiệu quả chưa cao, vì vậy cần có những nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine dựa trên các nghiên cứu độc tố của vi khuẩn này.
Tài liệu tham khảo
1. Aragon V., Bouchet B., Gottschalk M (2010), Invasion of endothelial cells by systemic and nasal strains of Haemophilus parasuis. Veterinary journal (London, England : 1997): 186(2):264-267.
2. Biberstein E.L., White D.C (1969), A proposal for the establishment of two new Haemophilus species. J Med Microbiol: 2(1):75-78.
3. Bouchet B., Vanier G., Jacques M., Auger E., Gottschalk M (2009), Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells: limited role of LOS in apoptosis and pro- inflammatory cytokine release. Microb Pathog: 46(2):108-113.
4. Bouchet B., Vanier G., Jacques M., Gottschalk M (2008), Interactions of Haemophilus parasuis and its LOS with porcine brain microvascular endothelial cells. Veterinary research: 39(5):42.
5. Cai X., Chen H., Blackall P.J., Yin Z., Wang L., Liu Z., Jin M (2005), Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China. Veterinary microbiology: 111(3-4):231-236.
6. Cerda-Cuellar M., Aragon V. (2008), Serum-resistance in Haemophilus parasuis is associated with systemic disease in swine. Veterinary journal (London, England : 1997): 175(3):384-389.
7. Costa-Hurtado M., Ballester M., Galofre-Mila N., Darji A., Aragon V. (2012a), VtaA8 and VtaA9 from Haemophilus parasuis delay phagocytosis by alveolar macrophages. Veterinary research: 43(57.
8. Costa-Hurtado M., Olvera A., Martinez-Moliner V., Galofre-Mila N., Martinez P., Dominguez J., Aragon V. (2013), Changes in macrophage phenotype after infection of pigs with Haemophilus parasuis strains with different levels of virulence. Infection and immunity: 81(7):2327-2333.
9. Elwell C.A., Dreyfus L.A. (2000), DNase I homologous residues in CdtB are critical for cytolethal distending toxin-mediated cell cycle arrest. Molecular microbiology: 37(4):952-963.
10. Frandoloso R., Martinez-Martinez S., Gutierrez-Martin C.B., Rodriguez-Ferri E.F. (2012).
Haemophilus parasuis serovar 5 Nagasaki strain adheres and invades PK-15 cells. Veterinary microbiology: 154(3-4):347-352.
11. Fu S., Yuan F., Zhang M., Tan C., Chen H., Bei W (2012a), Cloning, expression and characterization of a cell wall surface protein, 6-phosphogluconate dehydrogenase, of Haemophilus parasuis. Research in veterinary science: 93(1):57-62.
12. Galdiero S., Falanga A., Cantisani M., Tarallo R., Della Pepa M.E., D'Oriano V., Galdiero M. (2012), Microbe-host interactions: structure and role of Gram-negative bacterial porins. Current protein & peptide science: 13(8):843-854.
13. Hill C.E., Metcalf D.S., MacInnes J.I. (2003), A search for virulence genes of Haemophilus parasuis using differential display RT-PCR. Veterinary microbiology: 96(2):189-202.
14. Hood D.W., Makepeace K., Deadman M.E., Rest R.F., Thibault P., Martin A., Richards J.C., Moxon E.R. (1999), Sialic acid in the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae: strain distribution, influence on serum resistance and structural characterization. Molecular microbiology: 33(4):679-692.
15. Inzana T.J., Glindemann G., Cox A.D., Wakarchuk W., Howard M.D. (2002), Incorporation of N- acetylneuraminic acid into Haemophilus somnus lipooligosaccharide (LOS): enhancement of resistance to serum and reduction of LOS antibody binding. Infection and immunity: 70(9):4870-4879.
16. J. N.(1992). Haemophilus parasuis. State University: Iowa;526-528.
17. Jin H., Wan Y., Zhou R., Li L., Luo R., Zhang S., Hu J., Langford P.R., Chen H. (2008), Identification of genes transcribed by Haemophilus parasuis in necrotic porcine lung through the selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Environmental microbiology: 10(12):3326-3336.
18. Jin H., Zhou R., Kang M., Luo R., Cai X., Chen H. (2006), Biofilm formation by field isolates and reference strains of Haemophilus parasuis. Veterinary microbiology: 118(1-2):117-123.
19. Jinadasa R.N., Bloom S.E., Weiss R.S., Duhamel G.E. (2011), Cytolethal distending toxin: a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression, leading to apoptosis of a broad range of mammalian cell lineages. Microbiology (Reading, England): 157(Pt 7):1851-1875.
20. Jungi T.W., Adler H., Adler B., Thony M., Krampe M., Peterhans E. (1996), Inducible nitric oxide synthase of macrophages. Present knowledge and evidence for species-specific regulation. Veterinary immunology and immunopathology: 54(1-4):323-330.
21. Kielstein P., Rapp-Gabrielson V.J. (1992), Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts. Journal of clinical microbiology: 30(4):862- 865.
22. Kielstein P., Wuthe H., Angen O., Mutters R., Ahrens P. (2001), Phenotypic and genetic characterization of NAD-dependent Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance. Veterinary microbiology: 81(3):243-255.
23. Li J., Peng H., Xu L.G., Xie Y.Z., Xuan X.B., Ma C.X., Hu S., Chen Z.X., Yang W., Xie Y.P., Pan Y., Tao L. (2013), Draft Genome Sequence of Haemophilus parasuis gx033, a Serotype 4 Strain Isolated from the Swine Lower Respiratory Tract. Genome announcements: 1(3).
24. Lichtensteiger C.A., Vimr E.R. (2003), Purification and renaturation of membrane neuraminidase from Haemophilus parasuis. Veterinary microbiology: 93(1):79-87.
25. Martinez-Moliner V., Soler-Llorens P., Moleres J., Garmendia J., Aragon V. (2012), Distribution of genes involved in sialic acid utilization in strains of Haemophilus parasuis. Microbiology (Reading, England): 158(Pt 8):2117-2124.
26. Martinez S., Frandoloso R., Rodriguez-Ferri E.F., Gonzalez-Zorn B., Gutierrez-Martin C.B. (2010), Characterization of a recombinant transferrin-binding protein A (TbpA) fragment from Haemophilus parasuis serovar 5. FEMS microbiology letters: 307(2):142-150.
27. McVicker J.K., Tabatabai L.B. (2006), Isolation and characterization of the P5 adhesin protein of Haemophilus parasuis serotype 5. Preparative biochemistry & biotechnology: 36(4):363-374.
28. Morozumi T., Nicolet J. (1986), Morphological variations of Haemophilus parasuis strains. Journal of clinical microbiology: 23(1):138-142.
29. Mullins M.A., Register K.B., Bayles D.O., Butler J.E. (2011), Haemophilus parasuis exhibits IgA protease activity but lacks homologs of the IgA protease genes of Haemophilus influenzae. Veterinary microbiology: 153(3-4):407-412.
30. Munch S., Grund S., Kruger M. (1992), Fimbriae and membranes on Haemophilus parasuis. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B Journal of veterinary medicine Series B: 39(1):59-64.
31. Ogikubo Y., Norimatsu M., Kojima A., Sasaki Y., Tamura Y. (1999), Biological activities of lipopolysaccharides extracted from porcine vaccine strains. The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science: 61(12):1265-1269.
32. Oh Y., Han K., Seo H.W., Park C., Chae C. (2013), Program of vaccination and antibiotic treatment to control polyserositis caused by Haemophilus parasuis under field conditions. Canadian Journal of Veterinary Research: 77(3):183-190.
33. Oliveira S., Pijoan C. (2004), Haemophilus parasuis: new trends on diagnosis, epidemiology and control.
Veterinary microbiology: 99(1):1-12.
34. Olvera A., Ballester M., Nofrarias M., Sibila M., Aragon V. (2009), Differences in phagocytosis susceptibility in Haemophilus parasuis strains. Veterinary research: 40(3):24.
35. Olvera A., Martinez-Moliner V., Pina-Pedrero S., Perez-Simo M., Galofre-Mila N., Costa-Hurtado M., Aragon V., Bensaid A. (2013), Serum cross-reaction among virulence-associated trimeric autotransporters (VtaA) of Haemophilus parasuis. Veterinary microbiology: 164(3-4):387-391.
36. Olvera A., Pina S., Macedo N., Oliveira S., Aragon V., Bensaid A. (2012), Identification of potentially virulent strains of Haemophilus parasuis using a multiplex PCR for virulence-associated autotransporters (vtaA). Veterinary journal (London, England : 1997): 191(2):213-218.
37. Olvera A., Pina S., Perez-Simo M., Aragon V., Segales J., Bensaid A. (2011), Immunogenicity and protection against Haemophilus parasuis infection after vaccination with recombinant virulence associated trimeric autotransporters (VtaA). Vaccine: 29(15):2797-2802.
38. Olvera A., Pina S., Perez-Simo M., Oliveira S., Bensaid A. (2010), Virulence-associated trimeric autotransporters of Haemophilus parasuis are antigenic proteins expressed in vivo. Veterinary research:
41(3):26.
39. Pampusch M.S., Bennaars A.M., Harsch S., Murtaugh M.P. (1998), Inducible nitric oxide synthase expression in porcine immune cells. Veterinary immunology and immunopathology: 61(2-4):279-289.
40. Perry M.B., MacLean L.L., Gottschalk M., Aragon V., Vinogradov E. (2013), Structure of the capsular polysaccharides and lipopolysaccharides from Haemophilus parasuis strains ER-6P (serovar 15) and Nagasaki (serovar 5). Carbohydrate research: 378(91-97).
41. Pina S., Olvera A., Barcelo A., Bensaid A. (2009), Trimeric autotransporters of Haemophilus parasuis: generation of an extensive passenger domain repertoire specific for pathogenic strains.
Journal of bacteriology: 191(2):576-587.
42. Rapp-Gabrielson V.J., Gabrielson D.A., Schamber G.J. (1992), Comparative virulence of Haemophilus parasuis serovars 1 to 7 in guinea pigs. American journal of veterinary research:
53(6):987-994.
43. Ruiz A., Oliveira S., Torremorell M., Pijoan C. (2001), Outer membrane proteins and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites. Journal of clinical microbiology: 39(5):1757-1762.
44. Silversides D.W., Music N., Jacques M., Gagnon C.A., Webby R. (2010), Investigation of the species origin of the St. Jude Porcine Lung epithelial cell line (SJPL) made available to researchers. Journal of virology: 84(10):5454-5455.
45. Steenbergen S.M., Lichtensteiger C.A., Caughlan R., Garfinkle J., Fuller T.E., Vimr E.R. (2005), Sialic Acid metabolism and systemic pasteurellosis. Infection and immunity: 73(3):1284-1294.
46. Tadjine M., Mittal K.R., Bourdon S., Gottschalk M. (2004), Production and characterization of murine monoclonal antibodies against Haemophilus parasuis and study of their protective role in mice.
Microbiology (Reading, England): 150(Pt 12):3935-3945.
47. Tang C., Zhang B., Yue H., Yang F., Shao G., Hai Q., Chen X., Guo D. (2010), Characteristics of the molecular diversity of the outer membrane protein A gene of Haemophilus parasuis. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire: 74(3):233-236.
48. Vanier G., Szczotka A., Friedl P., Lacouture S., Jacques M., Gottschalk M. (2006), Haemophilus parasuis invades porcine brain microvascular endothelial cells. Microbiology (Reading, England): 152(Pt 1):135-142.
49. Wang X., Xu X., Wu Y., Li L., Cao R., Cai X., Chen H. (2013), Polysaccharide biosynthesis protein CapD is a novel pathogenicity-associated determinant of Haemophilus parasuis involved in serum-resistance ability.
Veterinary microbiology: 164(1-2):184-189.
50. Xu C., Zhang L., Zhang B., Feng S., Zhou S., Li J., Zou Y., Liao M. (2013), Involvement of lipooligosaccharide heptose residues of Haemophilus parasuis SC096 strain in serum resistance, adhesion and invasion. Veterinary journal (London, England : 1997): 195(2):200-204.
51. Zhang B., Feng S., Xu C., Zhou S., He Y., Zhang L., Zhang J., Guo L., Liao M. (2012a). Serum resistance in Haemophilus parasuis SC096 strain requires outer membrane protein P2 expression. FEMS microbiology letters: 326(2):109-115.
52. Zhang B., Xu C., Liao M. (2012c), Outer membrane protein P2 of the Haemophilus parasuis SC096 strain contributes to adherence to porcine alveolar macrophages cells. Veterinary microbiology: 158(1-2):226-227.
53. Zhang B., Xu C., Zhang L., Zhou S., Feng S., He Y., Liao M. (2013), Enhanced adherence to and invasion of PUVEC and PK-15 cells due to the overexpression of RfaD, ThyA and Mip in the DeltaompP2 mutant of Haemophilus parasuis SC096 strain. Veterinary microbiology: 162(2-4):713-723.
54. Zhang N.Z., Chu Y.F., Gao P.C., Zhao P., He Y., Lu Z.X. (2012e), Immunological identification and characterization of extracellular serine protease-like protein encoded in a putative espP2 gene of Haemophilus parasuis. The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science: 74(8):983-987.
55. Zhou H., Yang B., Xu F., Chen X., Wang J., Blackall P.J., Zhang P., Xia Y., Zhang J., Ma R. (2010), Identification of putative virulence-associated genes of Haemophilus parasuis through suppression subtractive hybridization. Veterinary microbiology: 144(3-4):377-383.
56. Zhou M., Zhang A., Guo Y., Liao Y., Chen H., Jin M. (2009), A comprehensive proteome map of the Haemophilus parasuis serovar 5. Proteomics: 9(10):2722-2739.
57. Zhou M., Zhang Q., Zhao J., Jin M. (2012), Haemophilus parasuis encodes two functional cytolethal distending toxins: CdtC contains an atypical cholesterol recognition/interaction region. PloS one:
7(3):e32580.
58. Zhou S.M., Xu C.G., Zhang B., Feng S.X., Zhang L.Y., Zou Y., Liao M. (2013a), Natural IgG antibodies in normal rabbit serum are involved in killing of the ompP2 mutant of Haemophilus parasuis SC096 strain via the classical complement pathway. Veterinary journal (London, England : 1997): 196(1):111-113.
59. Zou Y., Feng S., Xu C., Zhang B., Zhou S., Zhang L., He X., Li J., Yang Z., Liao M. (2013), The role of galU and galE of Haemophilus parasuis SC096 in serum resistance and biofilm formation. Veterinary microbiology: 162(1):278-284.
VIRULANCE FACTORS OF HEMOPHYLUS PARASUIS, WHICH OF POTENTIAL PRODUCTION VACCINE
Nguyen Van Chao1,2, Vu Thi Thanh Tam3
1 Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
2 College of Agricultural and Forestry, Hue University
3 Mien Trung institute for scientific reseache, Hue city, Vietnam
Abstract: Haemophilus parasuis (H. parasuis) is a swine pathogen responsible for the Glässer’s disease, which has received more attention due to the increasing economic losses in the pig industry worldwide. The bacteria that causes of disease with severe symptoms such as respiratory infections, especially is meningitis.
The studies of H. parasuis were received little attention, while prevention and control of Glässer’s disease continues to be challenging. Understanding the pathogenicity of H. parasuis is essential for determining how this bacterium produces disease and to better distinguish between virulent and non-virulent strains. H.
parasuis pathogenic to animals by producing adhesion factor to invade host cells, resistance to phagocytosis by macrophages, resistance to serum complement and induction of inflammation. The paper provides information on lipooligosaccharide, spores components, membrane proteins, factors involved in transporting automatically. In addition, the article also provides information about some virulances factor of H. parasuis were able used to produce vaccine to prevent diseases caused by H. parasuis.
Keywords: Toxin, virulence, H. parasuis, vaccine.
