CÁC GIỐNG LAN GẤM VÙNG THẤT SƠN, TỈNH AN GIANG
Nguyễn Công Kha1, Lê Thị Ngọc Dung2, Nguyễn Phạm Tuấn3, Bùi Lan Anh4, Lâm Bảo Như Phương5, Nguyễn Phạm Tú6
COLLECTION AND ANALYZATION OF MORPHOLOGICAL, GENETIC SEQUENCES OF ORCHID HYBRIDS THAT SON AREA, AN GIANG
PROVINCE
Nguyen Cong Kha1, Le Thi Ngoc Dung2, Nguyen Pham Tuan3, Bui Lan Anh4, Lam Bao Nhu Phuong5, Nguyen Pham Tu6
Tóm tắt – Nghiên cứu “Sưu tập và phân tích hình thái, trình tự gene của các giống lan gấm vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang” nhằm lưu giữ các nguồn gen quý hiếm từ cây lan gấm và làm tiền đề cho quá trình chọn tạo các giống lan gấm có giá trị dược liệu cao. Kết quả thu thập được 06 giống lan gấm từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và được kí hiệu là AG1, AG2, AG3, AG4, AG5 và AG6. Phân tích hình thái học cho thấy, 06 giống lan gấm thu thập có các đặc điểm hình thái giống với chi lan gấm như màu sắc, hình dạng lá, thân và rễ. Phân tích trình tự gene 18S rRNA của vùng trình tự ITS (ITS1 và ITS4) cho thấy, mẫu lan gấm AG1 có độ tương đồng với Ludisia discolor voucher KFBG34 là 99,83%; mẫu lan gấm AG2 có độ tương đồng với Ludisia discolor AJ539483.1 là 99,51%; mẫu lan gấm AG3 có độ tương đồng với Ludisia discolor voucher S. W. Chung 448 là 99,35%; mẫu lan gấm AG4 có độ tương đồng với Ludisia discolor cultivar Nanjing 18S là 99,83%;
mẫu lan gấm AG5 có độ tương đồng với Lud- isia discolor voucher SM040 là 100%; mẫu lan gấm AG6 có độ tương đồng với Ludisia discolor MK451745.1 là 99,84%.
1,3,4,5,6
Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang
2Học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Email: ngphamtuan1983@gmail.com
Từ khóa: giải trình tự, cây lan gấm, hình thái học, ITS.
Abstract–The study "Collection and analyza- tion of morphological, genetic sequences of orchid hybrids That Son area, An Giang province" to store rare and precious genetic resources from broccoli and as a premise for breeding process and choose to create brocade orchids with high medicinal value. As a result, 06 brocade orchid varieties have been collected from That Son area, An Giang province and denoted by AG1, AG2, AG3, AG4, AG5 and AG6. Morphological anal- ysis showed that 06 orchid varieties collected had morphological characteristics similar to orchid hybrids such as color, leaf shape, body and root.
Sequence analysis of 18S rRNA gene of ITS re- gion (ITS1 and ITS4) showed that AG1 sample were similar to Ludisia discolor voucher KFBG34 (99,83%); AG2 sample were similar to Ludisia discolor AJ539483.1 (99,51%); AG3 sample were similar to Ludisia discolor voucher S. W. Chung 448 (99,35%); AG4 sample were similar to Lud- isia discolor cultivar Nanjing 18S (99,83%); AG5 sample were similar to Ludisia discolor voucher SM040 (100%); AG6 sample were similar to Lud- isia discolor MK451745.1 (99,84%).
Keywords: ITS, morphological, Anoectochilus sp, sequencing.
I. GIỚI THIỆU
Cây lan gấm (Anoectochilus sp) là nguồn dược liệu quý hiếm, được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhằm phục vụ chăm sóc sức khỏe của con người như thực phẩm chức năng, thuốc và các sản phẩm hỗ trợ khác,.. Lan gấm chứa nhiều hợp chất quý như flavonoid, phenolic, polysaccharide và kinsenoside, là hợp chất đầy tiềm năng và đầy hứa hẹn trong hỗ trợ và điều trị bệnh trong những năm trở lại đây. Các hợp chất này của cây lan gấm được sử dụng để chống oxy hóa khuẩn, virus, bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh và các bệnh liên quan tới lão hóa, chống ung thư, giảm đường trong máu, ngăn ngừa thoái hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc cơ thể và bảo vệ gan, chống tăng mỡ máu, chống viêm,. . . (Harleen et al., 2011; Nguyễn Văn Bình và ctv., 2018). Do nhu cầu sử dụng quá cao của người tiêu dùng cùng với sản lượng trong tự nhiên rất ít nên cây lan gấm đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam, là loài lan cần được bảo vệ trong tự nhiên. An Giang là tỉnh có nhiều cây dược liệu phong phú, đặc biệt là vùng thất sơn với nhiều loài dược liệu quý hiếm tồn tại trong tự nhiên cần khai thác và bảo tồn nguồn gen. Từ đó, nghiên cứu “Sưu tập và phân tích hình thái, trình tự gene của các giống lan gấm vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang” được thực hiện.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
A. Vật liệu
Bộ giống lan gấm gồm 06 giống lan gấm được thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và 03 giống lan gấm đối chứng có nguồn gốc từ Lâm Đồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Lâm Đồng) và được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang.
Dụng cụ và thiết bị như túi polypropylene, thước, máy chụp hình (Canon, Nhật Bản), cân phân tích (Ohaus, Mỹ), máy đo quang phổ (Hu- man, Hàn Quốc),. . . dụng cụ và thiết bị cần thiết khác.
B. Phương pháp
1) Sưu tập các giống lan gấm từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang: Nhóm nghiên cứu tiến hành đi thu
thập lan gấm ở vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang cùng với những người dân bản địa và chuyên gia về thực vật. Đồng thời, nhóm nghiên cứu cũng chuẩn bị các tài liệu và hình ảnh của các mẫu lan gấm để tiến hành thu thập, ghi chú kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu.
2) Phân tích đặc điểm hình thái của các giống lan gấm thu thập: Các mẫu lan gấm sau khi thu thập được tiến hành phân loại thành các nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái học về màu sắc, lá, gân lá và hoa. Đồng thời, các mẫu lan gấm cũng được phân loại theo Phạm Hoàng Hộ và Sách đỏ Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 1999; Bộ Khoa học và Công nghệ, 2007).
3) Phân tích trình tự gene của các giống Lan gấm thu thập: Các dòng lan gấm được tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự. Sau đó, dùng phần mềm Blast N để xác định loài và cây di truyền, gồm các giai đoạn sau: Quy trình trích DNA theo Trần Nhân Dũng (2011). Rút 2 mL dung dịch lan gấm cho vào tube 2,2 mL. Li tâm với tốc độ 13.000 vòng/10 phút. Cho một viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc. Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Li tâm 13.000 vòng/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới. Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, li tâm 13.000 vòng/5 phút, lấy phần tủa và bỏ phần dung dịch phía trên. Rửa phần tủa bằng 500µL Ethanol 70%, li tâm 13.000 vòng/5 phút. Sấy khô chân không trong 10 phút ở điều kiện nhiệt độ 45oC. Hòa tan trong 100 uL TE 0,1X. Trữ ở nhiệt độ -20oC. Sau khi li trích DNA từ các mẫu lan gấm thu thập, tiến hành phản ứng PCR gen 18S-rRNA bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Trình tự cặp mồi ITS1: 5’-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’.
Trình tự cặp mồi ITS4: 5’-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’.
Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen của các dòng lan gấm đã được giải trình tự với các trình tự đoạn gen của các dòng lan gấm trên ngân hàng gen (Genebank) để định danh các dòng lan gấm thu thập được.
Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR
Bảng 2: Chu kì phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene của lan
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A. Sưu tập các giống lan gấm từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang
Tại vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang, chúng tôi đã thu thập được 06 giống lan gấm có đặc điểm hình thái học giống với lan gấm. Các giống lan gấm sau khi thu thập được tiến hành ghi nhận địa điểm thu thập và kí hiệu các giống lan gấm (Bảng 3). Đồng thời, tiến hành thu thập 03 giống lan gấm từ tỉnh Lâm Đồng để làm đối chứng cho quá trình phân tích hình thái và trình tự gene của các giống lan gấm (Bảng 4).
B. Phân tích đặc điểm hình thái của các giống lan gấm thu thập
Tất cả các mẫu lan gấm thu thập đều được xác định tên khoa học dựa vào đặc điểm hình thái của thân, rễ, lá và hoa (theo mô tả đựợc công bố trong
“Sách Đỏ Việt Nam, phần II. Thực vật” và phân loại các loài lan kim tuyến trong “Cây cỏ Việt Nam” của GS. Phạm Hoàng Hộ). Hình thái của thân, rễ, lá và hoa của các giống lan gấm thu thập
Bảng 3. Các mẫu lan gấm thu thập ở vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang
Bảng 4. Các mẫu lan gấm thu thập ở tỉnh Lâm Đồng
từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang (Hình 3) và tỉnh Lâm Đồng (Hình 4) có những đặc điểm giống và khác nhau như sau:
* Đặc điểm giống nhau của các giống lan gấm thu thập: Hoa của cây lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và tỉnh Lâm Đồng có hình dạng màu trắng.
* Đặc điểm khác nhau của các giống lan gấm thu thập
- Hình dạng lá của cây lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang có hình dạng oval hoặc trái xoan. Trong khi đó, cây lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng có hình dạng trái xoan hoặc hình
Hình 1: Các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang
Ghi chú: (a) An Giang 1; (b) An Giang 2; (c) An Giang 3; (d) An Giang 4; (e) An Giang 5 và An Giang 6 (f).
Hình 2: Các giống lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng
Ghi chú: (a) Lâm Đồng 1; (b) Lâm Đồng 2 và Lâm Đồng 3 (c).
trứng.
- Màu sắc lá của cây lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang có màu nâu với các gân màu cam hoặc đỏ (Hình 3b); lá có màu xanh nhạt với những đường gân màu vàng (Hình 3a, 3c và 3f) và lá có màu xanh đậm với ba gân lá (Hình 3d và 3e). Trong khi đó, cây lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng có màu sắc lá tím và màu xanh (Hình 4).
- Thân của cây lan gấm thu thập thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẫn và không phủ lông (Hình 1 và 2).
- Rễ của các cây lan gấm thu thập được mọc ra từ các mấu trên thân rễ, đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân kí sinh (Hình 1 và 2).
Hình 3: Hình dạng lá và màu sắc lá của các mẫu lan gấm thu thập ở vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang Ghi chú: (a) An Giang 1; (b) An Giang 2; (c) An Giang 3; (d) An Giang 4; (e) An Giang 5 và An Giang 6 (f).
Từ kết quả phân tích hình thái của các giống lan gấm thu thập, có thể khẳng định các giống lan gấm thu thập có đặc điểm giống với chi lan gấm (lan kim tuyến) và có thể chia làm hai chi, chiLudisia spvà chiAnoectochilus sp.
Hình 4: Hình dạng lá và màu sắc lá của các mẫu lan gấm thu thập ở tỉnh Lâm Đồng
Ghi chú: (a) Lâm Đồng 1; (b) Lâm Đồng 2 và Lâm Đồng 3 (c).
C. Phân tích trình tự gene của các giống Lan gấm thu thập
Phân tích điện di sản phẩm PCR của các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và giống lan gấm đối chứng (tỉnh Lâm Đồng) cho thấy, các giống lan gấm thu thập có trình tự chiều dài khoảng 800 bp (Hình 5).
Từ kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng 18S rRNA
Hình 5: Kết quả phân tích điện di của các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và giống lan gấm đối chứng (Lâm Đồng)
Ghi chú: M: thang chuẩn; Lane 1: Lâm Đồng 1;
Lane 2: Lâm Đồng 2; Lane 3: Lâm Đồng 3; Lane 4: An Giang 1; Lane 5: An Giang 2; Lane 6: An Giang 3; Lane 7: An Giang 4; Lane 8: An Giang 5; Lane 9: An Giang 6; Lane 10: Đối chứng..
với cặp mồi ITS (ITS1 và ITS4) của các mẫu lan gấm thu thập ở An Giang, kết quả phân tích cho thấy các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang được chia làm 06 nhóm, cụ thể như sau:
Nhóm 1: Mẫu lan gấm AG1 thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang là Ludisia discolor voucher KFBG34 với độ tương đồng là 99,83%.
Nhóm 2: Mẫu lan gấm AG2 thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang là Ludisia discolor AJ539483.1 với độ tương đồng là 99,51%.
Nhóm 3: Mẫu lan gấm AG3 thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang là Ludisia discolor voucher S. W. Chung 448 với độ tương đồng là 99,35%.
Nhóm 4: Mẫu lan gấm AG4 thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang làLudisia discolorculti- var Nanjing 18S với độ tương đồng là 99,83%.
Nhóm 5: Mẫu lan gấm AG5 thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang là Ludisia discolor voucher SM040 với độ tương đồng là 100%.
Nhóm 6: Mẫu lan gấm AG6 thu thập từ vùng
Thất Sơn, tỉnh An Giang là Ludisia discolor MK451745.1 với độ tương đồng là 99,84%.
Tương tự, từ kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành giải trình tự các mẫu lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng vùng 18S rRNA với cặp mồi ITS (ITS1 và ITS4), kết quả phân tích cho thấy các giống lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng được chia làm 03 nhóm, cụ thể như sau:
Nhóm 1: mẫu lan gấm LĐ1 thu thập từ tỉnh Lâm Đồng là giốngAnoectochilus roxburghiicul- tivar Qingyuan 18S tương đồng 100%.
Nhóm 2: mẫu lan gấm LĐ2 thu thập từ tỉnh Lâm Đồng là giống Anoectochilus lylei voucher SM011 tương đồng 100%.
Nhóm 3: mẫu lan gấm LĐ3 thu thập từ tỉnh Lâm Đồng là giống Anoectochilus formosanus voucher SCMR9412004 tương đồng 99,83%.
Từ kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR và kết quả giải trình tự gene vùng 18S rRNA với cặp mồi ITS (ITS1 và ITS4) của các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và các giống lan gấm thu thập từ tỉnh Lâm Đồng (đối chứng), chúng tôi tiến hành phân tích đa dạng hệ di truyền bằng phần mềm BioEdit và phần mềm MEGA X. Kết quả phân tích cây phát sinh loài của các giống lan gấm thu thập từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và tỉnh Lâm Đồng được trình bày trong Hình 6. Mối quan hệ di truyền của các mẫu lan gấm được xác định dựa trên trình tự gene vùng ITS bằng thuật toán Maximum Likelihood với hệ số bootstrap 1.000 (phần mềm MEGA 10) (Hình 6). Kết quả phân tích trình tự gene vùng ITS của 09 mẫu lan gấm thu thập (06 vùng Thất Sơn, An Giang và 03 mẫu Lâm Đồng) cho thấy, có sự phân thành hai nhóm rõ rệt, cụ thể như sau:
Trong đó, 03 mẫu lan gấm thuộc chi Anoec- tochilus sp được phân về một nhóm I, bao gồm 02 nhóm nhỏ: nhóm Ia (01 mẫu) và nhóm Ib (02 mẫu). Nhóm Ia gồm các mẫu Anoectochilus lylei và giốngAnoectochilus formosanus. Trong khi đó, nhóm Ib là giốngAnoectochilus roxburghii.
06 mẫu lan gấm thuộc chi Ludisia spphân về nhóm II, bao gồm 04 nhóm nhỏ: nhóm IIa (01 mẫu), nhóm IIb (02 mẫu) và nhóm IIc (03 mẫu).
Trong đó, nhóm IIa là mẫu lan gấm giốngLudisia discolor AJ539483.1; nhóm IIb gồm các mẫu lan gấm như là Ludisia discolorvoucher SM040
Hình 6: Sơ đồ cây phát sinh loài của các giống lan gấm thu thập vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang và tỉnh Lâm Đồng (đối chứng)
Ghi chú: AG1: Ludisia discolor voucher KFBG34; AG2: Ludisia discolor AJ539483.1;
AG3: Ludisia discolor voucher S. W. Chung 448; AG4: Ludisia discolor cultivar Nanjing 18S; AG5: Ludisia discolor voucher SM040;
AG6: Ludisia discolor MK451745.1; LĐ1:
Anoectochilus roxburghii cultivar Qingyuan 18S;
LĐ2: Anoectochilus lylei voucher SM011;
LĐ3: Anoectochilus formosanus voucher SCMR9412004..
vàLudisia discolor MK451745.1; nhóm IIc gồm các mẫu lan gấm như Ludisia discolor voucher KFBG34;Ludisia discolorvoucher S. W. Chung 448 vàLudisia discolorcultivar Nanjing 18S.
IV. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thu thập được 06 giống lan gấm từ vùng Thất Sơn, tỉnh An Giang. Các giống lan gấm thu thập có đặc điểm hình thái học như màu sắc, dạng lá, thân và rễ giống đặc điểm của loài lan gấm. 06 mẫu lan gấm thu thập được phân tích trình tự gene 18S rRNA và thuộc chiLudisia sp.
Kết quả nghiên cứu làm tiền đề cho quá trình đánh giá hoạt tính sinh học của các mẫu lan gấm và làm nguồn bố mẹ cho quá trình lai tạo giống lan gấm mới.
V. LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học và Sở Khoa học & Công nghệ tỉnh An
Giang đã tạo điều kiện và hỗ trợ để thực hiện nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bộ Khoa học và Công nghệ, 2007.Sách đỏ Việt Nam, phần II. Thực vật. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
[2] Harleen, K.S., K. Bimlesh, P. Sunil, T. Prashant, S.
Manoj, S. Pardeep, 2011. A Review of Phytochem- istry and Pharmacology of Flavonoids.Internationale pharmaceuticasciencia, 1(1).
[3] Nguyễn Văn Bình, Phạm Thị Phương, Nguyễn Tá Lợi, 2018. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide toàn phần trong nấm linh chi đỏ. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái nguyên, 180 (04):3-8.
[4] Phạm Hoàng Hộ, 1999.Cây cỏ Việt Nam. NXB Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh.
[5] Trần Nhân Dũng, 2011.Sổ tay thực hành sinh học phân tử. NXB Đại học Cần Thơ.
