Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Kỹ thuật nghiên cứu
2.5.3. Điện di DNA sau tách chiết
Ở pH =8, acid nucleic mang điện tích âm; dưới tác dụng của dòng điện một chiều, acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Tùy vào mục đích có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di acid nucleic, nhưng phổ biến nhất là sử dụng gel agarose. Thông thường người ta sử dụng nồng độ gel là 1,5%.
Bản gel điện di được nhuộm bằng ethidium bromide sẽ phát sáng.
Chất lượng của DNA tốt khi vạch điện di rõ nét, băng gọn. Ngược lại, phân tử DNA bị đứt gãy, lẫn nhiều protein hoặc các tạp chất khác thì hình ảnh điện di là một vệt trải dài không tạo thành băng gọn.
Cách chuẩn bị gel agarose 1,5%
- Cân 1,5 g agarose hoà tan trong 10 mL boric acid EDTA (TBE). Sử dụng lò vi sóng để agarose tan, sau khi agarose tan hết để nguội 55-60oC, đổ vào khuôn gel. Để bản gel đông lại và ổn định hoàn toàn mới sử dụng.
- Gỡ lược, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.
- Pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA).
Tris 0,89 M; acid boric 0,89 M; EDTA 2,02 M
Tiến hành kỹ thuật điện di
- Đổ bản gel agarose 1,5% với 6 hoặc 12 giếng rồi ngâm vào bể điện di.
- Nạp 5 μl sản phẩm khuếch đại PCR vào các giếng trên bản gel.
- Nạp 2,5 μl Marker loại 100 bp vào 1 giếng còn lại.
- Sử dụng máy điện di 80-100V (Mupid- Nhật), điện di ở hiệu điện thế 100V khoảng 30 phút.
- Sau điện di, gel được ngâm vào ethidium bromide 5 phút, rửa qua nước cất và đưa vào soi dưới đèn tử ngoại, chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại, nhận định hình ảnh và chụp hình lưu trữ.
2.5.4. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) nhân đoạn gen HV1, HV2 Quy trình: DNA sau khi được tách chiết và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch đạt yêu cầu được sử dụng làm khuôn mẫu để khuyếch đại đoạn gen HV1 và HV2 bằng máy PCR Eppendorf. Tất cả các mẫu DNA được tách chiết đều được pha loãng về nồng độ khoảng 40 ng/μl để thực hiện phản ứng PCR.
- Thành phần của phản ứng PCR: 10X đệm PCR; 2,5mM dNTP; mồi xuôi và ngược; 0,5unit Taq polymerase; DNA và H2O, tổng thể tích 20µl.
Thành phần Thể tích (l)
Nước cất PCR 11,9
Buffer 10X 2,0
dNTP (2,5 mM) 2,0
Mồi xuôi 0,5
Mồi ngược 0,5
Taq polymerase (5 u/l) 0,1
DNA 3,0
Tổng 20,0
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC - 5 phút; 30 chu kỳ [94oC- 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 30 giây]; 72oC - 5 phút; bảo quản mẫu ở 15oC.
- Sản phẩm PCR được điện di cùng với thang chuẩn 100bp trên gel agarose 1,5%. Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. Phản ứng PCR đạt yêu cầu khi chỉ có 1 băng duy nhất với mỗi đường chạy, băng rõ nét, kích thước so trên thang DNA chuẩn tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết.
2.5.5. Giải trình tự vùng HV1 và HV2 (DNA sequencing)
- Tinh sạch DNA sử dụng Kit QIAGEN (Hilden, Germany).
- Giải trình tự gen theo quy trình và sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Tiến hành trên máy 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM. So sánh với trình tự GenBank để xác định đa hình.
Quy trình thực hiện:
Tinh sạch DNA (sử dụng Kit QIAGEN)
- Cho 500 µl dung dịch PB vào ống chứa 10 µl DNA, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Hút hết dịch cho qua cột tinh sạch (do hãng Qiagen cung cấp).
- Quay ly tâm 10000 v/p trong 30 giây, đổ bỏ dịch ở đáy ống.
- Cho tiếp 750 µl PE vào cột.
- Ly tâm 10000 v/p trong 30 giây, đổ bỏ dịch phía đáy ống.
- Ly tâm tiếp thêm 60 giây để loại bỏ hết dịch trong cột.
- Lấy cột ra, cho vào ống eppendorf 1,5 mL.
- Cho 50 µl dung dịch EB (gồm 10 mM Tris-Cl, pH 8,5).
- Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm 10000 v/p trong 60 giây.
- Dịch thu được ở đáy ống là dịch chứa DNA đã được tinh sạch.
Quy trình thực hiện giải trình tự gen:
Thực hiện theo qui trình và sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị master mix cho phản ứng PCR.
- Chuẩn bị effendorf 0,2ml đã đánh dấu sẵn thứ tự các mẫu.
- Chuẩn bị hóa chất để thực hiện phản ứng.
- Làm tan hoàn toàn hóa chất, trộn đều sau đó ly tâm nhẹ để toàn bộ dịch trên nắp ống rơi xuống.
- Tiến hành pha master mix theo bảng sau:
Thành phần Thể tích (l)
Sản phẩm sau PCR đã được tinh sạch 1,0
Big Dye Buffer 1X 3,0
Big Dye terminator V3.1 (2,5X) 2,0
Nước cất PCR 13,0
Mồi đơn (5pmol/µl) 1,0
Tổng 20
Chú ý:
- Toàn bộ khâu chuẩn bị master mix phải được thực hiện trên khay đá.
- Các hóa chất phải được làm tan và trộn đều trước khi sử dụng.
- Big dye 2,5X phải được bảo quản tránh ánh sáng.
- Mỗi DNA thực hiện hai phản ứng với mồi xuôi và mồi ngược.
+ Giai đoạn 2: Chạy PCR Sequencing.
- Sau khi chuẩn bị master mix cho phản ứng xong, ly tâm nhanh các ống PCR để toàn bộ dịch dính trên thành và nắp ống xuống dưới và làm tan bọt.
- Xếp các ống effendorf vào máy PCR.
- Chọn chương trình nhiệt đã được cài đặt sẵn trong máy theo chu trình đã được tối ưu hóa.
- Kiểm tra lại toàn bộ chu trình nhiệt:
Chu trình Biến tính Bắt cặp Tổng hợp
1 95oC - 2 phút
2 – 25 95oC - 5 giây 50oC - 10 giây 60oC - 4 phút Bảo quản ở 10oC
- Ấn nút “Start” cho máy bắt đầu chạy chương trình.
- Sau khi chạy xong chương trình đưa máy về chế độ nghỉ và tắt máy - Lấy mẫu ra khỏi máy PCR
- Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng Big dye kit sẽ được tinh sạch bằng big Dye temination để loại bỏ toàn bộ big dye thừa và đem đọc trên máy giải trình tự gen ABI 3100 vant (Applied Biosystem)
- Các nucleotid trên gen sẽ được biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với 4 mầu tương đương với 4 loại nucleotid A,T,G,C.
Kết quả giải trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự chuẩn J01415 trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) để xác định đa hình trên hai vùng HV1 và HV2 của DNA ty thể.
2.5.6. Phương pháp phân tích trình tự đoạn HV1 và HV2
Giải trình tự gen từ vị trí 15.974 đến vị trí 16.517 có chứa trình tự vùng HV1 và từ vị trí 8 đến vị trí 431 có chứa trình tự vùng HV2. Vùng HV1 được xác định là từ vị trí 16.024 đến 16.365 và trình tự cho vùng HV2 được xác định từ vị trí 73 đến 340. Mỗi mẫu được giải trình tự theo cả hai hướng (5’ và 3’) để tránh nhiễu và xác định trình tự gen cũng như phát hiện các điểm đa hình là đầy đủ nhất.
Trình tự vùng HV1 và HV2 mtDNA của các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự chuẩn Cambridge (rCRS) đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu về DNA ty thể (http://mitomap.org) bằng phần mềm sinh học chuyên dụng (CLC Main Workbench 6.0.1). Đồng thời cũng so sánh các đặc điểm đa hình của các mẫu nghiên cứu với các đặc điểm đa hình đã được công bố trên MITOMAP (A Human Mitochondrial Genome Database).
Xác định độ đa dạng di truyền (genetic diversity) và xác suất trùng lặp ngẫu nhiên giữa hai cá thể trong quần thể nghiên cứu được tính theo công thức: h= (1- Σ𝑥2)n(n-1); trong đó: h là độ đa dạng di truyền, Σ𝑥2 là xác xuất trùng lặp ngẫu nhiên giữa hai cá thể trong quần thể, x là tần suất xuất hiện của haplotype trong quần thể và n là số mẫu, theo Fumio Tajima năm 1989 [105].
2.5.7. Phân tích mối liên quan giữa một số đa hình đơn nucleotid (SNP) trên vùng HV1 với bệnh ung thư vú
Phương pháp thống kê và kiểm định Chi-Square (χ2) trên phần mềm SPSS 12.0.1 được sử dụng để đánh giá tỷ lệ các SNP và mối tương quan giữa chúng với ung thư vú.
Xác định mối liên quan giữa một số SNP của vùng HV1 mtDNA bằng phân tích tương quan. Ước tính nguy cơ gây bệnh được biểu thị bằng tỉ số odds (Odds ratio-OR) và khoảng tin cậy 95% (95% confidence interval-95% CI).