Các bước nghiên cứu

1/ Bước 1. Thu thập mẫu nghiên cứu

+ Thu thập các mẫu mô bệnh đúc paraffin theo tiêu chuẩn chọn mẫu, cách chọn mẫu (trong mục 2.1.1; 2.1.3).

+ Thu thập bệnh án nghiên cứu theo danh sách

+ Thu thập các thông tin nghiên cứu khác qua gọi điện cho người thân.

2/ Bước 2. Tách DNA và bảo quản - 20˚C:

- Nguyên tắc kỹ thuật tách DNA: sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).

- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu mô paraffin (phụ lục 1).

- Đo nồng độ DNA tổng số sau tách chiết DNA, đảm bảo có DNA với nồng độ khoảng ≥ 25 ng/µl, độ tinh sạch khoảng 1,8 - 2,0. Nếu nồng độ và độ tinh sạch không đảm bảo cần tách chiết lại đến khi đảm bảo để chạy được PCR.

- Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ và bảo quản DNA trong tủ âm (< 0⁰C).

3/ Bước 3. Nhân bản các exon của các gen nghiên cứu cần xác định các đột biến (gen TP53, gen FGFR, gen EGFR).

- Nguyên tắc kỹ thuật: dựa trên cơ sở tính biến tính, hồi tính của DNA, và hoạt tính của các DNA polymerase có khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn [86].

- Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng các exon trên các gen để nhân bản từng exon nghiên cứu, nguồn gốc mồi: các cặp mồi nhân bản các exon 2, 3, 7, 8 gen EGFR; exon 12, 13 gen FGFR do Trung tâm Gen - Protein Trường Đại học Y Hà Nội thiết kế, mồi nhân bản exon 7+8 gen TP53 dựa theo công thức mồi trong nghiên cứu Roger H. Frankel (1992) [94]… , mồi nhân bản gen dạng EGFRvIII của hãng MRC Hà Lan thiết kế.

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gen Exon Trình tự mồi Kích thước

sản phẩm base pair (bp)

Hãng sản xuất

TP53 7+8 Mồi xuôi 5′- GGTTGGGAGTAGATGGAGCC-3′

Mồi ngược 5′-ATGCCCCAATTGCAGGTAAA -3′ 495 IDT Mỹ

EGFR

2 Mồi xuôi 5′- GG ACC TTG AGG GAT TGT TT-3′

Mồi ngược 5′- CTT CAA GTG GAA TTC TGC CC-3′ 312 IDT Mỹ 3 Mồi xuôi 5′- TTAGGGTTCAACTGGGCGTC-3′

Mồi ngược: 5′- AGCCTTCTCCGAGGTGGAAT-3′ 321 IDT Mỹ 7 Mồi xuôi 5′-GCT TTC TGA CGG GAG TCA AC-3′

Mồi ngược 5′-AGA CAG AGC GGG AAC AGG AT-3′ 296 IDT Mỹ 8 Mồi xuôi 5′-CT TCC ATC ACC CCT CAA GA-3′

Mồi ngược 5′-CTC AGC AGC CGA GAA CAA-3′ 261 IDT Mỹ Bộ 10

exon Các mồi exon 2,3,4,5,6,7,8,13,16,23 trong 1 kit MRC Hà Lan

FGFR

12 Mồi xuôi 5´-GCAGATGCATCCAGATGGTA-3´

Mồi ngược 5´-TCTCCATTCATGGCCACATA-3´ 617 IDT Mỹ 13 Mồi xuôi 5´-TGTGAAGAAGAACAAGCCTGC-3´

Mồi ngược 5´-AGAACTCCGTGAGATCGTGC-3´ 527 IDT Mỹ

- Các cặp mồi sử dụng để nhân bản các exon trong xác định xóa đoạn gen ở dạng các đầu dò, được thiết kế để xác định số lượng bản sao các exon của gen EGFR và gen EGFRvIII trong bệnh UNBTKĐ: bao gồm các đầu dò xác định exon 1 (tên thăm dò MRC-Holland: 2062-L3282) exon 2 (5435-L4851), exon 3 (5436-L4852), exon 4 (5437-L4853), exon 5 (5438-L6027), exon 6 (6121-L6286), exon 7 (5440-L4856), exon 8 (2063-L3283), exon 13 (5441-L5612), exon 16 (2064-L1577) và exon 23 (5968-L5385). Kèm theo là 12 đầu dò tham khảo và bắt buộc phải có hình ảnh trên sản phẩm điện di trong các mẫu.

- Sử dụng quy trình kỹ thuật nhân bản DNA dò (MLPL), để xác định đột biến dạng EGFRvIII (phụ lục 4).

- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật PCR (phụ lục 2), để nhân bản các exon trên gen xác định đột biến điểm.

4/ Bước 4. Điện di sản phẩm PCR

* Điện di trên gel arogase:

- Mục đích: kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cho việc giải trình tự - Yêu cầu: chạy điện di trên gel arogase, đảm bảo băng điện di rõ nét, không có sản phẩm phụ, kích thước bằng với mẫu chuẩn [86].

- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di là hiện tượng các phân tử mang điện dịch chuyển trong điện trường dưới tác dụng của dòng điện, phân tử tích điện âm di chuyển về cực (+) và phân tử tích điện dương dịch chuyển về cực (-).

Acid nucleic là phân tử mang điện tích âm nhờ khung phosphat của mình, dưới tác dụng của dòng điện một chiều acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển khác nhau. Tùy mục đích, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di DNA, phổ biến nhất là sử dụng gel agarose.

- Quy trình kỹ thuật: thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật (phụ lục 2) - Nếu chưa sử dụng cần lưu trữ, bảo quản sản phẩm PCR trong tủ âm (< 0⁰C).

+ Điện di mao quản:

- Nguyên tắc kỹ thuật: điện di mao quản (CE - capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện áp cao thế (15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản.

- Quy trình kỹ thuật: thực hiện đúng quy trình chạy điện di mao quản (phụ lục 4).

Hình 2.1. Hình ảnh kết quả chạy điện di mao quản mẫu DNA chuẩn của người nam (sử dụng bộ kit SALSA MLPA P105 của hãng hóa chất

MRC-Hà Lan sản xuất; hình ảnh do hãng hóa chất cung cấp)

+ Yêu cầu: hình ảnh điện di rõ, mẫu chuẩn chứa đủ 55 đỉnh tương ứng 55 đầu dò MLPA (đối với chuẩn nam), chứa 54 đỉnh (đối với chuẩn nữ): gồm các sản phẩm nhân bản từ 126 đến 500 nucleotid, 9 đoạn điều khiển tạo ra một sản phẩm nhân bản nhỏ hơn 120 nucleotid: bốn mảnh DNA (Q-fragments) tại vị trí 64-70-76-82 nucleotid, ba đoạn điều khiển biến tính DNA (Dfragments) tại vị trí 88-92-96 nucleotid, một mảnh X ở vị trí 100 nucleotid và một mảnh Y ở vị trí

105 nucleotid. Trong đó có 12 đỉnh tương ứng 12 đầu dò để kiểm soát về độ nhạy và độ đặc hiệu (vị trí và kích thước/ nghĩa là các đỉnh này bắt buộc phải hiển thị trên hình ảnh điện di mao quản trong các mẫu).

- Kết quả điện di được đọc trên máy tính, đảm bảo đúng các tiêu chuẩn của phương pháp đo, các đỉnh điện di rõ nét, tất cả các đỉnh chuẩn phải rõ ràng, đạt kích thước cho phép.

5/ Bước 5. Giải trình tự với các cặp mồi tương ứng.

- Nguyên tắc kỹ thuật: giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nuceotid trong phân tử DNA, dựa trên nguyên tắc sử dụng các nucleotid tự do ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh [88]. Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, qua hệ thống điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích.

Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích.

- Thực hiện theo đúng quy trình kỹ thuật giải trình tự (phụ lục 3).

- Kết quả giải trình tự đảm bảo rõ nét, các đỉnh nucleotid rõ, không đứt đoạn, không nhiễu.

6/ Bước 6. Phân tích kết quả

* Kết quả giải trình tự

- Đọc kết quả giải trình tự các exon và so sánh tương ứng với mẫu chuẩn trên Gen - Bank bằng phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1.

- Trình tự nucleotid trên các exon được đọc bằng các tín hiệu huỳnh quang dựa trên nguyên tắc cảm quang, biểu hiện bằng trình tự các đỉnh sóng với mỗi loại nucleotid A, T, G, C lần lượt tương ứng với một màu khác nhau xanh lá, đỏ, đen, xanh dương. Bình thường mỗi vị trí nucleotid chỉ tương ứng 1

đỉnh sóng 1 màu, khi có sự biến đổi về nucleotid, sẽ xuất hiện 2 sóng trên cùng một vị trí hoặc mất hẳn sóng chính và thay bằng đỉnh sóng của một loại nucleotid khác. Kết quả của giải trình tự gen được thể hiện bằng hình ảnh là các đỉnh sóng liên tiếp nhau tương ứng với trình tự của các nucleotid trên exon.

- Nếu mẫu nào không đạt (nhiễu, không đọc được kết quả), cần tinh sạch lại sản phẩm PCR và giải trình tự lại đến khi đọc được kết quả. Nếu vẫn không được cần làm lại PCR (bước 3), không được thì cần tách lại DNA (bước 2). Có thể chạy giải trình tự bằng mồi ngược nếu mồi xuôi kết quả vẫn không đọc được.

* Phân tích kết quả xóa đoạn dạng EGFRvIII

Phân tích kết quả bằng công cụ Coffalyser chuyên biệt (được cung cấp bởi hãng MRC - Hà lan).

Nguyên tắc: dựa vào số lượng các bản sao của các exon đã nhân bản được, để xác định có xóa đoạn EGFRvIII, cần tính trung bình cộng số lượng bản sao của các exon 2+3+4+5+6+7 chia cho trung bình cộng số lượng bản sao của các exon 1+8+13+16+23 của gen EGFR (gọi là tỷ lệ EGFRvIII). Tỷ lệ EGFRvIII dưới 0,8 đã được coi là chứa biến thể xóa đoạn EGFRvIII.

2.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu