Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của TD0014 trên áp lực thể hang (intracarvenous
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Gajbhiye và cộng sự (2015) [45] như sau:
- Chuột cống đực được đặt trong phòng yên tĩnh, hạn chế tối đa mọi kích thích - Chuột cống đực được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 6 con.
+ Lô 1: uống dung môi pha thuốc với thể tích 10 mL/kg + Lô 2: uống sildenafil liều 6 mg/kg
+ Lô 3: uống TD0014 liều 1,8 g dược liệu/kg (liều tương đương liều dự kiến dùng trên người, tính theo hệ số 6)
Cho chuột ở các lô nghiên cứu uống nước cất/thuốc thử một lần trước khi tiến hành đo ICP. Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột ở các lô được tiến hành đo ICP theo quy trình như sau:
- Chuẩn bị
+ Động vật được gây mê bằng dung dịch ketamin liều 25 mg/kg, cố định nằm ngửa trên bàn mổ, sát trùng.
+ Kết nối hệ thống Powerlab, điện cực kích thích, đầu đo áp lực, phần mềm Labchart.
- Tiến hành
+ Bước 1: Bộc lộ và đặt catheter vào động mạch cảnh để đo huyết áp động mạch + Bước 2: Bộc lộ dây thần kinh hang
+ Bước 3: Bộc lộ thể hang, đặt một kim 26G vào thể hang, nối kim với một ống PE-50 chứa nước muối sinh lý pha heparin 100 UI/mL để đo ICP
+ Bước 4: Đo áp lực thể hang, huyết áp động mạch trước khi kích thích dây thần kinh hang.
+ Bước 5: Đo áp lực thể hang, huyết áp động mạch sau khi kích thích dây thần kinh hang. Số lần kích thích là 3 lần, khoảng cách giữa các lần kích thích là 10 phút, mỗi lần kích thích kéo dài 1 phút. Dòng điện kích thích dây thần kinh hang có cường độ 5V, tần số 20Hz, độ rộng xung 2ms.
+ Bước 6: Phân tích số liệu offline bằng phần mềm Labchart pro. Kết quả sau phân tích cho ra các thông số về áp lực thể hang, huyết áp động mạch (đơn vị mmHg).
Các chỉ số nghiên cứu
- ICP trước khi kích thích dây thần kinh hang (ICP nền) (mmHg)
- ICP đỉnh sau khi kích thích dây thần kinh hang (mmHg) và thời gian đạt đến ICP đỉnh (ms)
- Sự biến đổi của ICP theo thời gian (diện tích dưới đường cong ICP) (mmHg-s) - Thời gian đáp ứng với kích thích (ms)
- Tỷ số ICP đỉnh/huyết áp động mạch trung bình (ICP/MAP) Các chỉ số nghiên cứu được so sánh giữa các lô.
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của TD0014 trên chuột cống trắng bị gây suy giảm chức năng sinh sản bằng natri valproat
2.3.4.1. Tác dụng bảo vệ của TD0014 trên chuột cống trắng bị gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat
Chuột cống đực trưởng thành, được chia ngẫu nhiên thành 4 lô nghiên cứu.
Chuột đực ở các lô được uống natri valproat (dung môi pha là nước cất) để gây suy giảm sinh sản (SGSS) và uống thuốc thử (dung môi pha là nước cất) theo thứ tự trong ngày như sau:
Lô nghiên cứu Uống lần 1 Uống lần 2
Lô 1
(Chứng sinh học) Uống nước cất 10 mL/kg Uống nước cất 10 mL/kg Lô 2
(Mô hình) Uống nước cất 10 mL/kg Uống natri vaproat 500 mg/kg Lô 3
(TD0014 liều thấp)
Uống TD0014 liều 1,8 g dược liệu/kg
Uống natri vaproat 500 mg/kg Lô 4
(TD0014 liều cao)
Uống TD0014 liều 5,4 g dược liệu/kg
Uống natri vaproat 500 mg/kg
Chuột được uống song song natri valproat và thuốc thử liên tục trong thời gian 7 tuần, khoảng cách giữa 2 lần uống trong ngày cách nhau ít nhất 3 giờ. Sau 5 tuần nghiên cứu, tiến hành ghép chuột, 1 chuột đực được ghép ngẫu nhiên với 2 chuột cái trong thời gian 2 tuần. Kết thúc 7 tuần nghiên cứu, đánh giá các chỉ số nghiên cứu trên chuột đực và chuột cái như sau:
- Chuột đực:
+ Lấy máu động mạch cảnh, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng nồng độ testosteron bằng kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)
+ Các cơ quan sinh dục (tinh hoàn, túi tinh, mào tinh, tuyến Cowper, đầu dương vật, tuyến tiền liệt, cơ nâng hậu môn – hành hang) được bóc tách và đem cân trọng lượng.
+ Mật độ tinh trùng và tỷ lệ sống của tinh trùng, tiêu bản hình thái tinh trùng.
+ Tỷ lệ di động của tinh trùng (tiến tới nhanh, tiến tới chậm, không tiến tới, và không di động), và tốc độ di động của tinh trùng.
+ Hình thái mô học của tinh hoàn sử dụng kỹ thuật nhuộm Hematoxyline-Eosin (do PGS.TS Nguyễn Thị Bình đọc kết quả).
- Chuột cái: tỷ lệ mang thai của chuột cống cái.
Các chỉ số nghiên cứu được so sánh giữa các lô với nhau.
2.3.4.2. Tác dụng phục hồi của TD0014 trên chuột cống trắng bị gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat
Chuột cống đực trưởng thành, được chia ngẫu nhiên thành 4 lô nghiên cứu.
Chuột đực ở các lô 2, 3 và 4 được uống natri valproat (dung môi pha là nước cất) liên tục trong 7 tuần để gây SGSS. Sau 7 tuần uống natri vaproat, chuột đực ở các lô được uống nước cất hoặc thuốc thử như sau:
- Lô 1 (Chứng sinh học): uống nước cất với thể tích 10 mL/kg - Lô 2 (Mô hình): uống nước cất với thể tích 10 mL/kg
- Lô 3 (TD0014 liều thấp): uống TD0014 liều 1,8 g dược liệu/kg/ngày - Lô 4 (TD0014 liều cao): uống TD0014 liều 5,4 g dược liệu/kg/ngày
Chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tục trong thời gian 10 ngày.
Sau 10 ngày uống thuốc, tiến hành ghép chuột, 1 chuột đực được ghép ngẫu nhiên với 2 chuột cái trong thời gian 2 tuần. Kết thúc thời gian ghép cặp, đánh giá các chỉ số nghiên cứu trên chuột đực và chuột cái như sau:
- Chuột đực:
+ Lấy máu động mạch cảnh, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng nồng độ testosteron bằng kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)
+ Các cơ quan sinh dục (tinh hoàn, mào tinh, túi tinh, tuyến Cowper, đầu dương vật, tuyến tiền liệt, cơ nâng hậu môn – hành hang) được bóc tách và đem cân trọng lượng.
+ Mật độ tinh trùng và tỷ lệ sống của tinh trùng, tiêu bản hình thái tinh trùng + Tỷ lệ di động của tinh trùng (tiến tới nhanh, tiến tới chậm, không tiến tới, và
không di động), và tốc độ di động của tinh trùng.
+ Hình thái mô học của tinh hoàn sử dụng kỹ thuật nhuộm Hematoxyline-Eosin (do PGS.TS Nguyễn Thị Bình đọc kết quả).
- Chuột cái: tỷ lệ mang thai của chuột cống cái.
Các chỉ số nghiên cứu được so sánh giữa các lô với nhau.