Các phương pháp, kỹ thuật nghiên cứu

2.2.5.1. Thu thập thông tin bệnh, đặc điểm đại thể, vi thể Nhóm hồi cứu

Nghiên cứu từ tháng 1/2008 – 6/2013: 220 trường hợp

 Thông tin về hành chính, lâm sàng, kết quả phân tích gen MYCN, đặc điểm đại thể được đánh giá qua hồ sơ bệnh án và phiếu kết quả sinh thiết tại Bệnh viện Nhi trung ương.

 Đặc điểm tổn thương vi thể được đánh giá qua thu thập và phân tích tiêu bản, khối nến chứa bệnh phẩm. Cắt nhuộm lại, nhuộm đặc biệt hoặc nhuộm hoá mô miễn dịch theo tiêu chuẩn nhuộm HMMD, mục 2.1.2 .

Nhóm tiến cứu

Nghiên cứu từ tháng 7/2013 – tháng 12/2015: 125 trường hợp

 Khai thác thông tin

- Ghi nhận thông tin về hành chính gồm họ tên, tuổi, giới, đặc điểm biểu hiện bệnh qua bệnh án và qua tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân.

- Xác định vị trí u qua bệnh án, chẩn đoán hình ảnh và biên bản phẫu thuật.

 Đại thể

- Các trường hợp cắt hết u: Đo và ghi nhận kích thước bệnh phẩm, xác định kích thước lớn nhất, đơn vị cm.

- Những trường hợp sinh thiết một phần u và sinh thiết kim: xác định kích thước lớn nhất dựa vào CT/MRI. Ghi nhận màu sắc u: Sẫm màu, sáng màu, hỗn hợp.

- Có ổ chảy máu hoại tử hay không, ổ chảy máu lan toả hay thành nốt.

- Có ổ canxi hoá hay không (đối chiếu với vi thể).

 Vi thể

- Mẫu bệnh phẩm được lấy ở vùng vỏ, trung tâm u các vị trí nhiều tổn thương. Phần u còn lại được lưu giữ trong formol trung tính 10% đề phòng khi cần lấy mẫu thêm. Mẫu sinh thiết mở và mẫu sinh thiết kim lấy toàn bộ.

- Mảnh sinh thiết được cố định trong dung dịch formol trung tính 10%, chuyển đúc và nhuộm H-E theo quy trình thường quy, đọc dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại từ 40 - 400 lần.

- Những trường hợp u không biệt hóa được nhuộm HMMD theo tiêu chuẩn mục 2.1.2, để chẩn đoán xác định. HMMD sử dụng phương pháp chuỗi polyme (Polymeric method, Envision systerms), kháng thể của hãng Dako – Đan Mạch, đánh giá kết quả trên KHV quang học.

2.2.5.2. Phân típ mô bệnh học

Áp dụng phân loại của INPC [68].

Bảng 2.1. Phân loại u NBTK theo INPC (1999-2003) - U NBTK (nghèo mô đệm schwann)

Không biệt hoá Ít biệt hoá Đang biệt hoá

- U hạch NBTK thể nốt (bao gồm giàu mô đệm schwann/nổi bật mô đệm schwann và nghèo mô đệm schwann)

- U hạch NBTK thể hỗn hợp (giàu mô đệm schwann) - U hạch thần kinh (mô đệm schwan nổi bật)

Đang trưởng thành Trưởng thành

2.2.5.3. Phân loại giai đoạn bệnh

Áp dụng phân loại giai đoạn u NBTK quốc tế INSS 1993 (Bảng 1.4) [82]

để so sánh phân loại giai đoạn và tổng hợp loại trừ u nguy cơ cao.

Áp dụng phân loại giai đoạn u NBTK quốc tế INRGSS 2009 [83] để so sánh phân loại giai đoạn và phân tích yếu tố tiên lượng (Bảng 2.2).

Bảng 2.2: Phân loại giai đoạn u NBTK quốc tế INRGSS 2009

Giai đoạn Mô tả

L1 U khu trú không liên quan đến cơ quan sinh tồn xác định trong danh sách IDRFs và khu trú ở một khoang cơ thể.

L2 U tại một vùng cơ thể với sự có mặt của 1 hoặc hơn số lượng yếu tố nguy cơ IDRFs^*.

M Di căn xa (không bao gồm MS)

MS Trẻ dưới 18 tháng, u di căn đến da, gan và/ hoặc tủy xương, tế bào u < 10% tế bào tủy.

2.2.5.4. Đánh giá di căn

- Di căn xương: CT, MRI có tổn thương và sinh thiết xương (+); hoặc khi có xạ hình xương (+) và/hoặc sinh thiết xương (+)

- Di căn tủy xương: Tủy đồ (+), đánh giá % tế bào u - Di căn các tạng: CT, MRI và/hoặc sinh thiết (+)

- Di căn mô mềm, hạch, vị trí khác: U NBTK tiên phát + sinh thiết hoặc xét nghiệm tế bào học vị trí di căn (+).

2.2.5.5. Nghiên cứu biểu hiện gen MYCN

- MYCN là gen nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 2 (2p24). Đánh giá có khuếch đại gen MYCN bằng kỹ thuật FISH thông qua việc gắn một cặp mồi DNA đã được đánh dấu huỳnh quang vào vùng gen MYCN.

- Mẫu bệnh phẩm tươi sau sinh thiết hoặc mẫu cắt từ khối nến sau loại nến được tiến hành lai đặc hiệu. Kỹ thuật được thực hiện tại khoa Di truyền và sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương. Lai đặc hiệu bằng đầu dò 2 màu LSI N-MYC (2p24) phổ xanh (Spectrum Green/CEP 2) và phổ da cam (Spectrum Orange - Vysis) để đánh dấu vào 2 vị trí trên NST số 2: màu xanh đánh dấu vào vị trí gen MYCN (2p24), màu đỏ da cam đánh dáu vào tâm động NST số 2. Phân tích bằng hệ thống KHV huỳnh quang với phần mềm ISIS.

Dựa vào số lượng tín hiệu xanh và đỏ sẽ cho biết số lượng bản sao của gen MYCN và số lượng NST số 2.

- Không có khuếch đại gen MYCN: mỗi tế bào có 2 tín hiệu xanh. Có khuếch đại gen MYCN: số tín hiệu xanh nằm rải rác hoặc tập trung thành cụm lớn, xác định khi số tín hiệu này ≥ 10.

2.2.5.6. Xác định nguy cơ và phương pháp chọn BN nguy cơ không cao - Dựa theo tiêu chuẩn nguy cơ của SIOPEN gồm nguy cơ cao và nguy cơ không cao (nguy cơ rất thấp, thấp, trung bình) [87],[88]. Bệnh nhân nguy cơ cao là các bệnh nhân giai đoạn 2, 3, 4, 4S có khuếch đại MYCN; hoặc giai đoạn 4, tuổi > 12 tháng, không khuếch đại gen MYCN [87]. Bệnh nhân nguy cơ không cao là các bệnh nhân còn lại sau đi đã loại đi nguy cơ cao.

2.2.5.7. Nghiên cứu yếu tố tiên lượng

Theo d i thời gian sống tính từ khi bắt đầu điều trị, kết thúc theo d i vào tháng 8/2018. Ghi nhận thời gian sống, chết, mất theo d i. Phân tích yếu tố tiên lượng theo thời gian sống của BN (mốc theo d i sống còn là 5 năm) gồm các yếu tố sau:

- Yếu tố tuổi: Đánh giá theo nhóm nghiên cứu yếu tố nguy cơ u NBTK quốc tế (INRG-International Neuroblastoma Risk Group) INRG. Mốc xác địch ranh giới tuổi là là 1,5 tuổi.

- Độ mô học (Nghiên cứu thời gian sống theo típ mô học): Gồm u NBTK (nghèo mô đệm schwann), u hạch NBTK thể nốt, u hạch NBTK thể hỗn hợp, u hạch thần kinh.

- Tiên lượng mô bệnh học: 2 nhóm tiên lượng gồm thuận lợi và không thuận lợi (Bảng 2.3).

Bảng 2.3: Tiên lượng MBH u NBTK theo phân loại INPC [68]

Tuổi (năm)

Độ mô học MKI < 1,5 1,5-5 > 5

Không biệt hoá Thấp - - -

Trung bình - - -

Cao - - -

Ít biệt hoá Thấp + - -

Trung bình + - -

Cao - - -

Đang biệt hoá Thấp + + -

Trung bình + - -

Cao - - -

Chú giải: +, tốt (m họ thu n lợi); -, xấu (m họ kh ng thu n lợi)

- Giai đoạn bệnh: Nghiên cứu thời gian sống theo phân loại giai đoạn bệnh của INRGSS (Bảng 2.2).

- Khuếch đại gen MYCN: Đánh giá thời gian sống theo 2 nhóm trường hợp có khuếch đại và không có khuếch đại gen MYCN.

- Các yếu tố tiên lượng khác: Tỷ lệ sống theo giới, canxi hóa, chảy máu hoại tử, vị trí u.

2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Đặc điểm hình thái học