CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Quy trình kỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứu
2.3.2. Quy trình kỹ thuật phát hiện HPV DNA và xác định genotype HPV
Hóa chất và sinh phẩm phát hiện HPV DNA Xác định genotype HPV
BỆNH PHẨM CỔ TỬ CUNG
HUYẾT TƯƠNG MẪU NGHIÊN CỨU
THÔNG TIN TỪ PHIẾU PHỎNG VẤN
Không xác định được genotype HPV
Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA
Phát hiện C. trachomatis N. gonorrhoeae
HPV DNA (+) Xét nghiệm tế bào
(Pap smear)
Phát hiện HIV, HBV, HCV Tách chiết
DNA tổng số Phân tích trên
SPSS 15.0
Phát hiện HPV Khuếch đại gen L1 HPV bằng PCR với mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified
GeneSquare HPV Typing DNA Microarray Kit
Xác định genotype HPV Giải trình tự gen sau tách dòng và phân tích kết quả
* Hóa chất và sinh phẩm tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm cổ tử cung: Sử dụng bộ sinh phẩm SMITEST DNA extraction kit (Genome Science Laboratories, Fukushima, Japan) gồm:
+ Dung dịch đệm phân hủy hồng cầu (Red cell lysing buffer): Triton X-100, Ion Mg2+.
+ Dung dịch phân hủy protein: Proteinase K, Guanidine, HCl.
+ Dung dịch 2-propanol.
+ Ethanol 100%, Ethanol 70%.
* Hóa chất và sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR khuếch đại HPV DNA +10X Buffer, 2mM dNTP, 25mM MgCl2, 5M AmpliTaq Gold (Invitrogen, Carlsbad, CA).
+ Mồi GP5+/GP6+ original hoặc mồi GP5+/GP6+ modifile . Bảng 2.2.Trình tự nucleotide của các mồi GP5+/GP6+
Loại mồi Tên mồi Base Trình tự mồi %GC
TM (Nhiệt độ
bắt cặp) GP5+/GP6+
original
GP5+ 23 tttgttactgtggtagatactac 46.1 51.9 GP6+ 25 gaaaataaactgtaaatcatattc 42.4 53.9
GP5+/GP6+
modified
GP5+M1 23 tttRttactgttgtWgatactac 43.4 42.5 GP5+M2 21 tgtWactgttgtWgataccac 44.7 46.2 GP5+M3 20 gtWactgttgtRgacaccac 46.9 45.9 GP6+M1 29 aattgaaaWataaactgtaaWtcatattc 45.0 55.0 GP6+M2 25 gaaacataaaYtgtaaatcaWattc 43.2 51.3 GP6+M3 21 gaaaatYtgcaaatcaWactc 41.7 50.6 (R: Pyrimidine C hoặc T; W: A hoặc T; Y: Purine A hoặc G)
* Dung dịch điện di phát hiện HPV DNA
+ Dung dịch đệm điện di TBE 0,5X: Pha loãng từ dung dịch gốc TBE 5X có thành phần như sau:
Tris base 27 g
Axit Boric 13,8 g
0,5M EDTA pH 8,0 10 ml
Nước khử ion vừa đủ 500 ml
Khuấy đều trên máy khuấy từ trong vòng 1 giờ.
+ Gel agarose 2%: Cân 2 gam agarose, bổ xung 100 ml đệm TBE 0,5X.
Đun tan trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút. Để nhiệt độ hạ xuống dần khoảng đến 50oC rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu.
+ Ethidium bromide (EtBr) dung dịch mẹ (10mg/ml): Hòa tan 1gam EtBr trong 100 ml nước. Khuấy vài giờ bằng máy khuấy từ cho tan đều. Giữ lọ màu ở nhiệt độ phòng. Khi dùng pha 20 µl dung dịch mẹ trong 100 ml đệm TBE 0,5X.
+ Đệm tra mẫu DNA (Loading buffer) 5X:
Tris-HCl 1M, pH 8,0 1ml EDTA 0,5M, pH 8,0 0,2 ml
Glycerol 2 ml
Bromphenol Blue 1% 2 ml
Hóa chất và sinh phẩm xác định genotype HPV
* Xác định genotype HPV bằng phương pháp DNA Microarray: Sử dụng bộ sinh phẩm GeneSQUARE HPV genotyping Kit (Kurabo, Osaka, Japan).
Kỹ thuật xác định genotype HPV : Multiplex PCR và Microarray Số lượng mẫu/phiến : 24 mẫu xét nghiệm/slide
Kích thước mẫu dò : 70 oligo DNA
Số lượng genotype HPV có thể xác định : 23 genotype
Hình 2.1. Kit xác định genotype HPV bằng kỹ thuật DNA microarray - Các gene gắn trong giếng gồm:
HPV genotype : HPV 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 66, 68.
(23 gene)
Gene nội kiểm : G3PDH (1 gene)
Gene ngoại kiểm : Gene có nguồn gốc từ Ecoli (2 gene) - Dung dịch đánh dấu huỳnh quang: Cy3 fluorescence.
- Dung dịch lai: NaCl 5% , Tris-sodium citrate 2%.
- Dung dịch Blocking
- Enzym gắn: Streptavidin-Alkaline Phosphatase.
- Dung dịch rửa: Tris-HCl buffer (NaCl 9%, Detegent 2%, Sodium azide 0,05%), Tris-sodium citrate 5%, Sodium Dodecyl Sulphate 0,5% (SDS 0,5%).
* Xác định genotype HPV bằng phương pháp giải trình tự gen sau tách dòng + Hóa chất và sinh phẩm tạo dòng gen HPV:
Chuyển nạp và biến nạp: Sử dụng bộ sinh phẩm TOPO TA cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) gồm: Dung dịch muối, TOPO vectơ (vectơ tách dòng pCR®2.1 đã mở vòng có đầu dính là Thimin), dung dịch SOC, X-gal 20mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn trên thạch Luria-Bertani:
Cao nấm men 10g
Trypton 10g
NaCl 10g
pH 7,4 (chỉnh bằng NaOH 5N) Agarose 2%
Tách và tinh sạch DNA plasmid: Sử dụng bộ sinh phẩm GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St Louis, USA).
Dung dịch Resuspension Solution:
Tris HCl, pH 8 25 mM
EDTA, pH 8 10 mM
Glucose 50 mM
Dung dịch Lysis buffer
NaOH 0,2 M
SDS 0,5% 1 %
Dung dịch Neutralization-Binding buffer Đệm axetat natri 3M, pH 5,5
Dung dịch Cloroform : isoamylalcol (24:1)
Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA) Dung dịch rửa
NaOAc 3M, pH 5,2 Ethanol 100%
+ Giải trình tự gen: Sử dụng bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gồm BigDye; Mồi xuôi và ngược;
Nước cất tinh sạch đã khử ion; 125mM EDTA; 3M NaOAc; 99% Ethanol;
70% Ethanol; HiDi formanide.
2.3.2.2. Trang thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật Bản).
- Máy ly tâm lạnh (Tomy MX 301,Kubota, Nhật Bản).
- Máy ủ và bình cách thủy nhiệt (Kubota, Nhật Bản).
- Lò vi sóng (Sanyo, Nhật Bản).
- Máy lắc ổn nhiệt 37oC, máy khuấy từ, máy khuấy trộn vortex (RotoLab, OSI).
- Tủ lạnh sâu – 30oC, – 80oC (Sanyo, Nhật Bản).
- Máy quang phổ kế Nano Drop (Thermo Scientific, Mỹ).
- Máy soi chụp ảnh gel (Sony, Nhật Bản).
- Cân phân tích 10-4g, cân điện tử 10-2g (Mettler Toledo).
- Bộ nguồn điện di (Bio - Rad), bộ điện di ADN (Advance Tech, Nhật Bản).
- Pipettman, đầu côn các loại (Gilson, Mỹ).
- Nồi khủ trùng Tomy MX 500 (Kubota, Nhật Bản).
- Máy PCR Biometra (Siemen, Nhật Bản)
- Máy GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) - Máy Microarray scanner GenePix4000B (Molecular Devices, Mỹ).
- Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, Biosystem, Mỹ).
2.3.2.3. Quy trình chi tiết phát hiện HPV DNA và xác định genotype HPV 2.3.2.3.1. Quy trình kỹ thuật phát hiện HPV
* Tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm cổ tử cung
Quy trình được thực hiện trong buồng hút vô trùng, tránh tạp nhiễm.
Ủ dung dịch Protein Dissolvent (solution II) ở 50-60oC đến khi tan hết tủa.
Cho 100 µl dịch bệnh phẩm cổ tử cung vào ống Eppendorf 1,5 ml, sau đó bổ xung 495 µl Protein Dissolvent (solution II) và 5 µl precipitator I. Trộn đều.
Ủ ở 50oC trong 30 phút. Lắc nhẹ trong thời gian ủ.
Giảm dần về nhiệt độ phòng.
Cho 500 µl dung dịch 2-propanol, trộn đều.
Cắm trên đá 15 phút.
Ly tâm 12,000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC.
Hút hết dịch nổi.
Cho 500 µl dung dịch Ethanol 70%, trộn đều.
Ly tâm 12,000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4oC.
Hút hết dịch nổi.
Cho 500 µl dung dịch Ethanol 70%, trộn đều.
Ly tâm 12,000 vòng/ phút trong 3 phút ở 4oC
Hút hết dịch nổi.
Làm khô trong buồng hút chân không trong 5-10 phút/
Cho 30 µl of nước tinh khiết vô trùng, để trong 2 phút.
Dùng ngay hoặc bảo quản ở -30oC.
* Kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA bằng phương pháp đo quang phổ
+ Phương pháp đo quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ DNA có trong mẫu nghiên cứu, đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu đã tách chiết.
+ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purin và pyrimidin. Từ giá trị mật độ quang học (OD - Optical Density) ở bước sóng 260 nm của mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu.
+ Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là 50 g/ml cho dung dịch DNA sợi đôi hoặc 40 g/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn theo công thức tính như sau trong đó C là nồng độ và d là độ pha loãng mẫu:
- Với dung dịch DNA sợi đôi: CDNA = OD260 x 50 x d
- Với dung dịch RNA hay DNA sợi đơn: CDNA/RNA = OD260 x 40 x d Cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch axit nucleic sau tách chiết được tinh sạch vì giá trị thật của nồng độ axit nucleic có thể bị sai lệch bởi các protein (cấu trúc từ acid amin thơm hoặc dị vòng: tyrosin, tryptophan, 1 số phenylalanin) trong sản phẩm tách chiết không tinh sạch cũng có khả năng hấp thụ ở bước sóng 260 nm. Tuy nhiên, các protein này lại hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, do đó ta đo thêm ở bước sóng 280 nm để kiểm tra độ sạch của dung dịch.
Để đánh giá mức độ sạch của dung dịch tách, người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T.
Nếu 1,7 < T < 2,0 thì dung dịch axit nucleic đó được coi là tinh sạch.
+ Cách tiến hành đo mật độ quang của DNA trong sản phẩm tách chiết bằng máy NanoDrop (Hitachi, Nhật Bản):
Nhỏ 1µl nước cất tinh khiết vô trùng (đã sử dụng trong quá trình pha loãng DNA khi tách chiết) vào buồng đọc để xác định kết quả ống trắng.
Trộn đều nhẹ nhàng sản phẩm tách chiết, ly tâm nhẹ. Nhỏ 1µl sản phẩm vào buồng đọc.
Máy tự động đánh giá nồng độ DNA và độ tinh sạch của sản phẩm trên đồ thị.
* Phản ứng PCR khuếch đại 140 bp vùng gen L1 HPV sử dụng mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified
+ Sử dụng mồi GP5+/GP6+ original cho phản ứng PCR:
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 26,25
10x Buffer 5
2mM dNTP 5
25mM MgCl2 7
20mM GP5+ 0,625
20mM GP6+ 0,625
Ampli Taq Gold 0,5
Sản phẩm DNA tách chiết 5
Tổng thể tích 50 µl
Chu trình nhiệt:
94oC 10 phút
94oC 45 giây
48oC 4 giây
38oC 30 giây
42oC 5 giây
66oC 5 giây
71oC 90 giây
72oC 10 phút
4oC vô cùng
45 chu kỳ
+ Sử dụng mồi GP5+/GP6+ modified cho phản ứng PCR:
Thành phần:
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 24,5
10x Buffer 5
2mM dNTP 5
25mM MgCl2 7
20mM GP5+ M1-2 0,5
20mM GP5+ M2-2 0,5
20mM GP5+ M3-2 0,5
20mM GP6+ M1-2 0,5
20mM GP6+ M2-2 0,5
20mM GP6+ M3 0,5
Ampli Taq Gold 0,5
Sản phẩm DNA tách chiết 5
Tổng thể tích 50 µl
Chu trình nhiệt:
95oC 10 phút
95oC 30 giây
45oC 30 giây
74oC 30 giây
74oC 10 phút
4oC vô cùng
+ Kiểm tra HPV DNA trong sản phẩm phản ứng PCR bằng điện di trên gel agarose:
- Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 2g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TBE 0,5X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống
45 chu kỳ
khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã cài sẵn lược. Sau khoảng 1h, khi gel đã đông, gỡ lược và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TBE 0,5X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1-2 mm.
-Tra mẫu DNA: Lấy 10 l sản phẩm PCR pha trong 2 l đệm tra mẫu 5X và tra vào các giếng nhỏ trong gel. Tra 6 l DNA marker thang 100 bp vào 1 giếng trên gel để làm chỉ thị phân tử.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, trong khoảng 30-40 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu BromophenolBlue để biết khi nào cần dừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Nhẹ nhàng lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 g/ml trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại.
2.3.2.3.2. Quy trình kỹ thuật xác định genotype HPV
Lựa chọn sản phẩm DNA tách chiết từ những mẫu có HPV DNA dương tính (phát hiện bằng phản ứng PCR với các cặp mồi GP5+/GP6+
original và GP5+/GP6+ modified) để xác định genotype HPV bằng kỹ thuật DNA microarray hoặc bằng phương pháp giải trình tự sau dòng hóa nếu xác định genotype HPV bằng kỹ thuật DNA microarray không thành công.
Xác định genotype HPV bằng GeneSquare HPV Typing DNA Microarray Kit Bước 1: Khuếch đại HPV DNA bằng phản ứng multiplex PCR
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 9,4
10x Buffer 2,5
2mM dNTP 2,5
25mM MgCl2 3,0
Mồi xuôi 0,25
Mồi ngược 0,25
DNA Taq polymerase 0,1
Sản phẩm DNA tách chiết 2
Tổng thể tích 20 µl
Chu trình nhiệt:
95oC 4 phút
95oC 30 giây
60oC 30 giây
72oC 60 giây
72oC 7 phút
4oC vô cùng
Các trình tự tổng hợp bổ xung tách ra, gắn với streptavidin, được đánh dấu bằng Cy3 -dUTP huỳnh quang 10µM.
Trong mỗi phản ứng, có chạy kèm mẫu nội kiểm dương (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) và nội kiểm âm để kiểm tra chất lượng multiplex PCR.
Bước 2: Lai DNA chuỗi đơn
Gây biến tính 20 µl sản phẩm PCR ở nhiệt độ 95oC trong 5 phút rồi cắm nhanh trên đá.
30 chu kỳ
Trộn 10 µl dung dịch lai và 6,2 µl rồi nhỏ vào từng giếng và ủ trong 2 giờ trên máy ở nhiệt độ 45 oC nhằm mục đích lai chuỗi DNA trong sản phẩm PCR đã đánh dấu huỳnh quang với trình tự bổ xung đã gắn sẵn trên giếng thứ 1.
Hút 8,0 µl sản phẩm lai sang giếng thứ 2, ủ trong 30 phút.
Nhỏ 500 µl dung dịch block.
Hút hết dịch và nhỏ 3 lần, mỗi lần 500 µl dung dịch rửa.
Bịt kín phiến kính có các giếng lai và thả chìm trong bình cách thủy trong 1 giờ ở nhiệt độ 65 oC.
Bước 3: Đọc kết quả
Làm khô tự nhiên và đọc kết quả trên máy microarray scan GenePix4000B (Molecular Devices, Mỹ) ở bước sóng 532nm, cường độ laser 100%, vị trí Focus 30 μm và kích thước điểm ảnh 10 μm.
Hình 2.2. Genotype HPV phát hiện bằng kỹ thuật DNA microarray trên máy scan
Xác định genotype HPV bằng phương pháp giải trình tự gen sau dòng hóa Bước 1: Ghép nối gen và biến nạp DNA plasmid vào E.coli chủng InVαF’
+ Ghép nối gen được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR (mồi GP5+/GP6+) vào vectơ tách dòng pCR®2.1 với các thành phần phản ứng (TOPO vectơ mix) như sau:
Dung dịch muối : 0,5 µl
TOPO vectơ : 0,5 µl
Sản phẩm PCR : 2,0 µl
Tổng thể tích : 3,0 µl
Để sản phẩm ghép ở nhiệt độ phòng 23 phút.
Cho 2,0 µl TOPO vectơ mix (DNA plasmid mix) vào E.coli chủng InVαF’, trộn nhẹ nhàng.
Cắm trên đá 17 phút.
Sốc nhiệt 42 oC trong 30 giây rồi cắm nhanh trên đá 7 phút.
Cho 250 µl dung dịch nuôi dưỡng S.O.C.
Ủ 1 giờ trong máy lắc nhiệt 37 oC với 200 vòng/phút.
Giàn đều dung dịch đã chuyển nạp trên thạch LB đã bổ xung ampicillin và phủ đều X-gal (20mg/ml) trên bề mặt.
Ủ mẫu ở 37 oC trong 16 giờ.
Hình 2.3. Vectơ tách dòng pCR®2.1
Bước 2: Kiểm tra kết quả ghép nối gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại vùng gen lacZα của vectơ tách dòng pCR®2.1.
Thành phần của phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 13,1
10x Buffer 2,0
2mM dNTP 2,0
25mM MgCl2 2,0
10M M13 xuôi 0,4 10M M13 ngược 0,4 5U Ampli Taq 0,1
Sản phẩm ghép gen Chấm trực tiếp trên khuẩn lạc trắng bằng tăm vô trùng Tổng thể tích 20 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
95oC 10phút
95oC 30 giây
55oC 30 giây 35 chu kỳ
72oC 60 giây
72oC 10 phút
4oC vô cùng
Điện di trên gel agarose 2%, những mẫu có băng kích thước khoảng 160 bp trên thạch là những mẫu ghép gen thành công.
Bước 3: Nuôi E.coli mang DNA plasmid
Nhân số lượng DNA lasmid bằng cách chọn những dòng E.coli đã mang DNA plasmid nuôi cấy trong 1,5 ml thạch LB lỏng, ủ 24 giờ trong máy lắc nhiệt 37 oC với 200 vòng/phút.
Bước 4: Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid
Chuyển thạch nuôi E.coli mang DNA plasmid vào ống Eppendorf 1,8 ml.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu xác tế bào.
Bổ xung 200 µl dung dịch I, trộn đều.
Bổ xung 200 µl dung dịch II, lắc trộn đều.
Bổ xung 350 µl dung dịch III, lắc nhẹ.
Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút
Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf có cột lọc.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, rút cột lọc và đổ dịch phía dưới.
Rửa DNA dưới đáy cột bằng 700 µl dung dịch rửa.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, đổ dịch đáy ống.
Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút.
Chuyển cột lọc sang Eppendorf mới.
Hòa tan DNA trong 100 µl.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu DNA đã hòa tan.
Kiểm tra độ tinh sạch DNA plasmid bằng quang phổ kế.
Bước 5: Xác định trình tự gen bằng máy tự động ABI 3100
Mỗi dòng gen được giải trình tự bằng 2 ống (1 ống với mồi xuôi và 1 ống với mồi ngược) theo cách tiến hành như sau:
+ Khuếch đại DNA plasmid bằng các dideoxynucleotid đã đánh dấu huỳnh quang.
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 12,0
5x Buffer 3,5
Mồi 1,5
BigDye 1,0
DNA plamid 2,0
Tổng thể tích 20 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng như sau:
96oC 10 giây
50oC 5 giây
60oC 4 phút
4oC vô cùng
+ Tinh sạch sản phẩm
Bổ sung 2 µl dung dịch 125mM EDTA pH 8,0, 2 µl dung dịch NaOAc và 50 µl Ethanol 99% vào mỗi ống chứa 20 µl sản phẩm ở phản ứng trên.
Votex và để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Ly tâm 14.000 vòng trong 20 phút, hút bỏ dịch nổi.
Bổ sung 70 µl dung dịch Ethanol 70%, lắc đều.
Ly tâm 14.000 vòng trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi.
Để khô DNA ở nhiệt độ phòng trong buồng tối.
Cho 25 µl Hi-Di formanide, votex.
Biến tính trên máy ủ nhiệt 95 oC trong 2 phút rồi cắm nhanh trên đá 15 phút.
Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100.
Bước 6: Phân tích trình tự DNA HPV xác định genotype
Trình tự DNA HPV thu được được phân tích so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế GenBank theo chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
2.3.3. Quy trình kỹ thuật xét nghiệm tế bào cổ tử cung theo phương pháp