CHUẨN HOÁ MÔI TRƯỜNG VÀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÁI NGUYÊN
Lã Duy Anh*, Nguyễn Phương Sinh Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Nghiên cứu về tế bào gốc ứng dụng trong lĩnh vực y học đều được khởi đầu từ nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi. Tuy nhiên tuỳ vào điều kiện thực tế của mỗi phòng thí nghiệm mà các nhà nghiên cứu đã xây dựng cho mình môi trường và kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc riêng.
Trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi đã nghiên cứu, tìm hiểu những điều kiện và kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc từ những phòng thí nghiệm trong và ngoài nước. Sau đó chuẩn hóa môi trường, kỹ thuật áp dụng vào phòng thí nghiệm tại trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
Chúng tôi đã tiến hành chuẩn hoá thành công môi trường và kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột. Kết quả nuôi cấy thành công dòng tế bào gốc phôi chuột cho thấy. Tế bào sinh trưởng tốt, hình thái điển hình, đủ điều kiện để định hướng biệt hoá thành các tế bào mong muốn.
Từ khóa: Tế bào gốc, tế bào gốc phôi chuột, nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, kỹ thuật nuôi cấy
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường nuôi cấy tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào [1].
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đặc biệt là các tế bào gốc phôi đã tạo cơ hội để nghiên cứu về sự phân hoá của tế bào gốc thành các loại tế bào khác nhau từ đó có những ứng dụng vào các nghiên cứu trong lĩnh vực y học [4].
Tế bào gốc phôi là một loại tế bào có khả năng tự làm mới và phân hoá toàn năng, dưới điều kiện nhất định có khả năng hình thành mọi loại tế bào của các tổ chức trong cơ thể động vật [5]. Chính vì vậy tế bào gốc phôi có tiềm năng nghiên cứu rất lớn và có khả năng ứng dụng vào lĩnh vực y học.
Trong những năm gần đây tế bào gốc đã chứng minh được tầm quan trọng và tiềm năng chữa bệnh có thể ứng dụng rất lớn trong y học. Chính vì vậy nghiên cứu về tế bào gốc đã được nhiều nhà khoa học và nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới tiến hành nghiên cứu.
Tuỳ thuộc vào điều kiện thực tiễn mà mỗi phòng thí nghiệm có thể xây dựng được môi trường và kỹ thuật nuôi cấy riêng. Đích đến
*Tel: 0912 866006, Email: laduyanh@gmail.com
của việc này là có thể nuôi cấy thành công dòng tế bào gốc phôi ổn định, để làm cơ sở tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu:
“Chuẩn hoá môi trường và kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột tại phòng thí nghiệm trường Đại học Y Dược Thái nguyên” với mục tiêu như sau:
- Chuẩn hoá thành công môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột;
- Chuẩn hóa thành công kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột;
- Nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu Tế bào gốc phôi chuột
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành ở phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
Thời gian: Từ tháng 1/2017 đến tháng 12/2017
Phương pháp nghiên cứu
Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi tham khảo các kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc
phôi chuột ở các phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam. Sau đó chuẩn hóa môi trường và kỹ thuật nuôi cấy áp dụng vào nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột tại phòng thí nghiệm trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
Hướng tới chuẩn hoá được môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột ổn định. Các tế bào nuôi cấy có chức năng giống với tế bào trong cơ thể động vật.
Sau khi nuôi cấy tế bào gốc phôi thai chuột, chúng tôi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang (Nikon) để quan sát tế bào nuôi cấy. Sau đó sử dụng phần mềm chụp ảnh bằng kính hiển vi (NIS-Elements Nikon) để tiến hành chụp, phân tích, xử lý hình ảnh tế bào.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chuẩn hoá môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột:
– Giá thể nuôi cấy;
– Thành phần hoá lí và sinh lí của môi trường nuôi cấy;
– Thành phần pha khí;
– Nhiệt độ tối ưu khi nuôi cấy.
Do tế bào động vật không có vách như tế bào thực vật và vi sinh vật nên chúng cần một giá thể để có thể trải rộng ra trong suốt quá trình tăng sinh. Với các tế bào bình thường, khi nuôi cấy chúng thường chỉ mọc thành lớp đơn và phủ kín bề mặt giá thể. Các giá thể thông thường bao gồm: Đĩa 96 giếng, 24 giếng và 6 giếng; bình nuôi bằng nhựa được sử dụng phổ biến, chúng có hai ưu điểm: (1) Giá thể có bề mặt phù hợp cho tế bào gắn bám và thấm được CO2 và O2; (2) bề mặt bằng nhựa mỏng, thích hợp cho việc quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học hay điện tử [2].
Thành phần quan trọng của pha khí là CO2 và O2. Trong nuôi cấy, áp lực oxy ở điều kiện khí quyển phù hợp cho hầu hết các tế bào nuôi cấy. Độ sâu (bề dày) của môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ oxy khuyếch tán vào tế bào, thông thường độ sâu
tối ưu của môi trường vào khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong nuôi cấy tĩnh. Vai trò của khí carbonic trong nuôi cấy tế bào động vật nói chung khá là phức tạp, do nhiều hoạt động tương hỗ giữa CO2 hoà tan, pH và nồng độ HCO3. Hệ đệm bicarbonat giúp duy trì pH mong muốn. Sản phẩm nuôi cấy chứa nhiều acid do CO2 nội sinh cao, nắp của bình nuôi cấy cho phép CO2 thừa được thải ra ngoài đồng thời CO2 từ tủ nuôi sẽ đi vào đệm cho môi trường. Mỗi hệ đệm có nồng độ CO2 thích hợp phụ thuộc vào từng loại môi trường dùng để nuôi cấy tế bào [2], [4].
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào người và động vật có vú là 370C, 5% CO2.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, chúng là hỗn hợp các yếu tố dinh dưỡng và các chất khác. Tùy theo từng loại tế bào khác nhau mà dùng môi trường thích hợp. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào được thiết lập gần giống như thành phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, amino acid, nhân tố tăng trưởng, hormone, các yếu tố vi lượng... và đặc biệt quan trọng là huyết thanh bò chửa. Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amino acid, acid béo, đường, các ion, các vitamin, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho các tế bào.
Từ những nghiên cứu kể trên chúng tôi tiến hành chuẩn hóa môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột. Thành phần dịch nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột được chuẩn hoá ổn định có thành phần như sau: Môi trường cơ bản D’MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium–Hãng Gibco)+ 15% huyết thanh thai bò chửa FBS (Fetal bovine serum - Hãng Gibco) + 1% Non-Essential Amino Acid/NEAA Solution (Hãng Hyclone) + 1%
GlutaMAXTM (Hãng Hyclone) + 1% Sodium Pyruvate (Hãng Hyclone)) + Leukemia inhibitory factor (1:10000 – Hãng Millipore) + 2-mercherapto ethanol (0.1 mM – Hãng Gibco) [4], [5].
Điều kiện nuôi cấy: Nuôi cấy trong tủ 37oC, CO2 nồng độ 5%.
Với thành phần tỉ lệ các hợp chất, điều kiện nuôi cấy như trên, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy thành công dòng tế bào gốc phôi chuột trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thí nghiệm đã được thực hiện nhiều lần và kết quả được thể hiện rõ nét qua hình ảnh tế bào nuôi cấy được chụp.
Trong quá trình làm thí nghiệm về sau này chúng tôi sẽ tìm ra thêm những tỉ lệ môi trường khác nhau để có thể nuôi cấy được các tế bào gốc phôi chuột ổn định hơn nữa.
Chuẩn hoá kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột
Nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột đòi hỏi thời gian và tuân thủ nghiêm ngặt kỹ thuật nuôi cấy từ tiến hành lấy mẫu đến nuôi cấy tế bào sinh trưởng, tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà chúng ta có thể định hướng tế bào duy trì tính toàn năng, hoặc là làm tế bào phân hóa [3]. Tế bào gốc phôi chuột nuôi cấy được khoảng 15 ngày thì đã phát triển đến giai đoạn cần phải chia tách tế bào, tức là cần phải loại bỏ bớt một số tế bào, giữ lại một số tế bào để bắt đầu một chu kì nuôi cấy mới. Trong một số trường hợp cần phải bảo quản tế bào ngay lập tức, không làm thí nghiệm tiếp mà cần phải lưu giữ tế bào, hay là cho tế bào ngủ đông thì chúng ta có thể thực hiện qua kỹ thuật đông lạnh tế bào.
Từ đó, chúng tôi đã tiến hành chuẩn hóa kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột theo ba bước như sau:
(1) Phục hồi tế bào (Cell recovery)
Chuẩn bị ống ly tâm 15 ml, thêm vào ống 1 ml dịch nuôi cấy tế bào. Hút tế bào đang bảo quản lạnh -80oC, cho vào bể ổn nhiệt 37oC rã đông nhanh các tế bào. Chuyển tế bào đã rã đông vào ống ly tâm 15 ml đã chuẩn bị trước đó. Dùng pipet mix nhẹ nhàng và thật đều ống nghiệm. Ly tâm 1000 rpm trong 5 phút, lúc này trong ống ly tâm sẽ chia hai pha, pha 1 là phần dịch nổi phía trên và pha 2 là phần cắn
tế bào lắng phía bên dưới. Hút bỏ phần dịch nổi phía bên trên. Dùng 2 ml dịch nuôi cấy tế bào đánh tan phần tế bào lắng ở đáy ống ly tâm, dùng pipet mix đều nhẹ nhàng rồi chuyển tế bào vào các đĩa nuôi cấy đường kính 6 cm/giếng. Đặt các đĩa vào tủ nuôi cấy tế bào (37oC, 5% CO2). Sau 12 h nuôi cấy, tiến hành thay dịch nuôi cấy tế bào, tiếp tục nuôi cấy cho tới khi tế bào sinh trưởng được khoảng 80-90% giếng nuôi cấy là có thể chia tách tế bào.
(2) Chia tách tế bào (Cell Passage)
Hút hết phần dịch nuôi cấy tế bào trong các đĩa đường kính 6 cm/giếng. Thêm một lượng thích hợp Trypsin-EDTA rửa một lần. Hút hết phần Trypsin-EDTA, mỗi giếng thêm khoảng 400 l 0,25% Trypsin-EDTA, để Trypsin- EDTA phát huy hoạt tính trong 1 phút. Nhẹ nhàng dùng pipet đánh bật các tế bào còn bám vào giếng nuôi cấy. Thêm vào 1 ml dịch nuôi cấy tế bào, dùng pipet mix đều đến khi các đám tế bào phân tán thành các tế bào đơn độc.
Hút phần dịch tế bào sang các ống ly tâm 15 ml. Ly tâm 1000 rpm trong 3 phút, lúc này trong ống ly tâm sẽ chia hai pha, pha 1 là phần dịch nổi phía trên và pha 2 là phần cắn tế bào lắng phía bên dưới. Loại bỏ phần dịch sau khi ly tâm, thu phần cặn tế bào. Thêm 1ml dịch nuôi cấy tế bào đánh tan phần cặn.
Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy tế bào, loại đường kính 6 cm/giếng (Các đĩa này đã được tráng 0,1% Gelatin qua đêm), mỗi giếng thêm 2 ml dung dịch nuôi cấy tế bào. Hút tế bào từ ống ly tâm vào các giếng nuôi cấy đảm bảo nồng độ1-1,5x105 tế bào/giếng.
(3) Đông lạnh tế bào (Freezing Cells)
Sau khi chia tách tế bào, dùng máy đếm tế bào sau đó hút tế bào vào các ống bảo quản đảm bảo nồng độ 3-5x105 tế bào/ống. Trong mỗi ống bảo quản đã chứa sẵn chất bảo quản với thành phần: 40% D’MEM + 50% FBS + 10% DMSO.
Nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thành phần, tỉ lệ các chất có trong môi trường nuôi cấy, kết hợp với kỹ thuật nuôi
cấy thích hợp là yếu tố quyết định tới việc nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột.
Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi đã gặp phải rất nhiều trường hợp các tế bào chỉ có thế sống được đến ngày thứ 7, thứ 8. Có trường hợp thì tế bào lại bị nhiễm khuẩn...
Nguyên nhân của hiện tượng trên đến từ hai nhóm chính: (1) Tỉ lệ các chất có trong môi trường nuôi cấy chưa hợp lý; (2) Trong quá trình làm thí nghiệm không tuân thủ nghiêm các qui trình làm thí nghiệm đã đề ra dẫn tới tế bào bị nhiễm khuẩn.
Để khẳng định nuôi cấy thành công dòng tế bào gốc phôi chuột chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy các tế bào gốc phôi chuột 8 lần.
Thực hiện chu kỳ phục hồi tế bào, chia tách tế bào, đông lạnh tế bào trên một dòng tế bào khoảng 36 lần. Sau khi tiến hành thí nghiệm như trên các tế bào vẫn giữ được hình thái tiêu chuẩn, sinh trưởng ổn định đã khẳng định nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột.
Với môi trường, điều kiện nuôi cấy, kỹ thuật nuôi cấy đã được chuẩn hóa ở trên, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột. Dưới kính hiển vi huỳnh quang (Nikon) hình ảnh tế bào đứng riêng rẽ, hình thái rõ ràng, tế bào sinh trưởng ổn định [6].
Đủ điều kiện để tiến hành định hướng biệt hoá các tế bào mong muốn.
Hình 1. Tế bào gốc phôi chuột ngày thứ 14 nuôi cấy KẾT LUẬN
Qua chuẩn hóa môi trường và kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột. Chúng tôi rút ra kết luận như sau:
- Chuẩn hoá thành công môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột.
- Chuẩn hoá thành công kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột.
- Nuôi cấy thành công tế bào gốc phôi chuột trong điều kiện phòng thí nghiệm.
KIẾN NGHỊ
- Chuẩn hoá thành công môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột là bước khởi đầu trong các nghiên cứu có liên quan đến tế bào gốc ứng dụng trong y học. Bên cạnh tế bào gốc phôi chuột còn có một số tế bào khác phục vụ trong nghiên cứu cần nuôi cấy. Vì vậy chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu, chuẩn hoá môi trường nuôi cấy nhiều loại tế bào khác.
- Sau khi chuẩn hóa thành công môi trường, nuôi cấy ổn định dòng tế bào gốc phôi chuột tiếp tục tiến hành các hướng nghiên cứu khác nhau nhằm khai thác triệt để tiềm năng nghiên cứu về tế bào gốc phôi chuột để ứng dụng vào y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dương Thị Bạch Tuyết và cộng sự (2005).
Bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh.
2. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
3. Lindvall O., Barker R. A., Brustle O. Svendsen, C. N (2012), “Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders”, Cell Stem.
Cell,10(2), p. 151-155.
4. Lu R., Yang A. and Jin Y (2011), “Dual functions of T-box 3 (Tbx3) in the control of self- renewal and extraembryonic endoderm differentiation in mouse embryonic stem cells”, J.
Biol. Chem., 286(10), pp. 8425-8436.
5. Weiying Lv (2014), The functions and molecular mechanisms of histone deacetylases in the lineages specification of mouse embryonic stem cell, Tong Ji University, Shanghai.
6. Weiying Lv, Xudong Guo, Guiying Wang et al, (2014), “Histone Deacetylase 1 and 3 Regulate the Mesodermal Lineage Commitment of Mouse Embryonic Stem Cells”, Plos. One, 10, pp. 1371 - 1374.
ABSTRACT
STANDARDIZING THE CULTURE ENVIRONMENT AND TECHNIQUE FORMOUSE EMBRYONIC STEM CELLS APPLIED IN THE LABORATORY AT THAI NGUYEN UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY
La Duy Anh*, Nguyen Phuong Sinh TNU - University of Medicine and Pharmacy
Stem cell research in the field of medicine has been started from successful embryonic stem cell culture. However, depending on the actual conditions of each laboratory, researchers have built their own stem cell culture environment and culture technique.
In this research, we have studied the conditions and techniques of stem cell culture from domestic and foreign laboratories. Then we standardize the environment and techniques of mouse embryonic stem cell culture is applied in the laboratory in TNU - University of Medicine and Pharmacy.
We have successfully standardized the environment and techniques of mouse embryonic stem cell culture. Successful transplantation of mouse embryonic stem cell line. Well-formed, morphologically-normal cells, which are capable of targeting differentiated cells into desired cells.
Keywords: Stem cells, mouse embryonic stem cells, culture, culture environment, culture technique.
Ngày nhận bài: 22/12/2017; Ngày phản biện: 23/12/2017; Ngày duyệt đăng: 30/01/2018
*Tel: 0912 866006, Email: laduyanh@gmail.com
