ĐẶC TÍNH SINH TÔNG HỢP VÀ ĐẶC TÍNH LÝ — HÓA CỦA XENLULAZA (Typ CMC - aza) ở ASPERGILLUS NIGER

TẠP CHÍ KHOA HỌC, N3 198G

ĐẶC TÍNH SINH TÔNG HỢP VÀ ĐẶC TÍNH LÝ — HÓA CỦA XENLULAZA (Typ CMC - aza) ở ASPERGILLUS NIGER

NGDYỄN ĐÌNII ỌUYẾN, TẠ DLY HIẾN NGỒ T ự THÀNHI

Sự khan hiếm proleio hiện nay khiến cho các nhà sinh học rgốy r à n g qu an tâm nghiên cứu s ử dụng bS xcnlulồza đề sản xuẵt thức ăn cho chồn nuói. Nhiều loài nẫni sợi có kbA năng phân piâi xenluloza d ượ c dùng vào mục đích này c h ư Mỵrothechim, oerrucaria, T n c h o d e n n a viride, Cỉiaetomlum cellulofyiicm vá PeniaiUỉỉiin ianttìinellum v.v.,.

Asp. niger là loài nấm sựi thirờti(» dùng trong si>ii xuẫt exit xilric và các onziin g l u c o a m y laza, xenluiaza. Do nãai kliông sinh độc tố n h ư n b i è n l o à i /Is- gilliis ktiác lại có khả năng phân giải cả tinh bột và xenluloza nén ỹân dây đă (ìirơc nghiên cứu s ử dụiig làm nguòn prolein đơn bào. Xcnlulaza ỗr A tp . nlger cũng duợc niộl aố lác giá quan tâm.Nbằm sừ (lụiig nám n à y d e sản xu ắ ts i nh kỉiỗi cho chán n u ỏ i c h ú a g tôi sơ bộ (ìm hiều một s5 đặc lính cùa ienhila>a ờ A.ip>. nfgcr

NGUYÊN LIỆU VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P

A.ip. nujer, chúng ít sinh bào tứ, thiiộc bộ sưu tập vi sinh r â l củ* Bộ môn Nám được giử trẽn inôi t r ư ờ n g Czapek — Dox và được nhân giống tro;ng n'.ói t r ư ở ng Hansen (lịch tỉiè.

' !ôi trường cơ sở đè sìin xuất xenliilaza li\ c;'im gạo. Cho vào binh móm 2ÕG111I in')! Ijinh lOg cám và lOml dung dịch sulfut amôm ^,9%. Khuilv đt;u rồi khử trùn ’ 1 íitm;30min. S au k. bi cấy cá c binh được g iữ 3G®C/'l ri{;ày.Thỏm \ Ì!0 m.ỗi bình TíOinl nirức cất (hay dung dịch đệm), lắc (ỉỗu,<fiữ lỉ {2ÌỞ/-i"C ròi li tàm. Dịjltìli (ảm là một nguồn xcnUilaza Ibò.

Hoại tínhcùa xcnlulaza(^(^ndo —và exoglucanaza)được pbál hiện í h e op hi ro ng p h á p k h u y ế c h l á n p h ó n g XÌỊ Irêii thạcli d ĩ a v ở i c ơ chất là c a c bo x í t — lUirUiJ — xenlulồza hoặc bột xenlulỏza (Sigma, u s . \ ) 0.1 %. Sau khi khoan (hạch wà r ) dịch cnzini các đĩa được giữ ở 50®C/ 24 giờ rồi đirực phun dung dịch Lugol đĩễ phát hiện vùng phàn giải cơ chăf.

Iloạt MnhcủaCMC — aza được xàc định bâng phương pháp (to (lộ nhứl (Tođa- eííil, l'J71) hay bâng phương pháp lĩo flư<Vng k h ử : đ u ờ n g kliỉr được Xiás định Iheo Vofova và KysUková (1979).

1. vỏfl sự cộ.ig lác của liOtint' thị lúc. Nịíỏ qu6 HtNrnịí và Đáo (ịuý ChcDiíí-

CMC — aza đ ượ c linh chế Iiiộl pbàn bang kếl lỏa với s u lí a t amiĩiôn lùi độ bão hòa 0%, (lirực cô đặc và loại muối n h ờ Sephadex G — 25. Điện dl (lén gt 1 poliacrvlamit đượu tiến hành {heo Davi* ( i y6'l).ĐS phát h i í n hoạt lính CMC — eza một cột gel khác; không nliuộm đ ư ợc cát ở d oạ n tirơng ứng vởi vị trl ciia đải p r o t e i n trôn CỘI g e l n h u ộ m A m i d o b l a c k lOB n ối tr ôn, c ắ t n b ỏ d o ạ n r.ày n gh i ền t r o n ^ 0 1 Iiil đệm axêtat 0.1 M PH '1,^ ròi phảt hỉện hoạt tinh Irên thạch chứa ỊC M C O .lỹ ^ .

KỄT QUẢ NGHIẼN cứu P háỉ hiện hoại lính xenlulaza

Mc>l s6 tác giả cho biết Asp. niger tông hợp chủ yếu endoglucanaza. Chúng lòi đ ả (lÙ!'g phương ph áp khuếch tán píióng xa Irên thach nhằm phát hiện cả hai h o ạ t tính cndo — và exoglucannaza. Mặc dù theo Williams CMC và bộl xe n"

luloza kém bắt ml\u vởi I6t, nhưníỊ một sỗ n hà nghiên cứu vẫn dùng Ihuổc I bử I r è n dè tuyền chọn nấm mổc phân giải xcnlulô/a. Kểt quẪ cho thấy h oà n toàn

c ỏ t h í t dùrií^ r l í i n g ( l ị c h L u ^ o l đ ề p h á t h i ệ n c ả h a i h o ạ i l i n h x e n l u l o z a . Đ i ề u đ á n g

chú ỹ 1« trôn môi t r ư ờ ng cám gạo chúng Asp. Iiiger không n h ữ n s tòng họp cndo inà câ exoglucniiaza. Đề có kểt luận chắc chììn về hoạt tinh endoglQcana7.fi, cbúiig tỏi cũng dùng phương pháp đo sự giảm độ nhốrt của (lúng dịch CMC là phươDỉí phá p rát nhạy với enzim trên Kết quả à h i n h 1 khẳng địnb chủng Asp. /ỉíợerphân giải r õ rệt CMC,

Ẵ n h hưởng cửa ngaồn các bon hữu eơ và nguần níiơ lẻn sinh tòng hợp CMC — aza & Asp.nìger

Hỉnh 1 : Ảnh hường của tlicằi uuỏi Axp. nlyer lên

■ự g i à m đ ộ n h ở t của CM(<

0.5%. I m í d ị c h lọc f 2ml đệm axélatÒ.lM PH 5 + 3ml CMC 0.5% giữ 30%C/

30 m i n rồỉ hùt r a 5ml cho vào nliớl kế OsUvald Tả đo.

1 0 0^

Các n g D Ô n xenlulôza t ự nhiên ả nh h ư ở ng khảc nhau lôn sinh tỗng hợp xen-

l alaza ĩr năm mổc. Chẳng hạn. Rao et a l , (1983) cho biết khi nuôi Peslaloliopsis versicolorịrèa một s6 cơ chất xenỉulôza thi bẵ m l a cho hoạt tinh cao nhát, còn kftJii nhát là cám mì. Hơn n ữa , r ơ m rạ xử kiềm khổng l ả m tăng ho*l tinh hơn

vỏri khổng xử lý. Trong thl nghiệm Asp. niger được DUÔi trêb cáiu n g u v Ề n và 41

m phổi Ir ộn vởi một ng uồ n xenlulôza khác. Kết qu â (bảng 1) cho t h í y t r ộ n h ỗn họp cám và bẵ mỉa (1:2) r ỉ m cbo hoat lính cao n h í t , * c ò n trén cám iiỊỊuyên h a v c ả m phổi trộn v ở i b ột cỏ nlylổ, v ỏ l ạ c , b ã d ứa h o ạ t t ỉ n h cn7.ini c h é n h lệch khòng đáng kỉ.

Đảng I. Ẳnh hưỏrng cũa cảc ng uồ n xenluloza tự nhién lên sinh t ồng h ợ p

CMC - aza ờ Asp. niger. •

Nguòn XenlulòEa Hoạt tinh CMC — aza

R — r, cm (1) Giucoza, aig/ml

Cám 0,50 0,30

C á m : bã niía ^{2 2 0} 0.74

Cám : bột cỏ í : 2 0.57 0.40

C á m : vỏ lạc 0.47 0.28

C á m : bã d ứ a 0.45 n.25

(1) R =. bán kính vòng Ẹhân giải, r = bá n kính lõ khoan

Năng lực đồng h6a cáo nguồn nỉtơ ỏrnẫm mốc cOng kbống gi^ng nhau. Chẳng h*n Trichoderm a vừide (Sícenberg, 1975) \ à Geotrichiim candiduiìì kbòng đồngi

hổa đ ượ c Ditrat. !

24 Ầ9 72 1 2 0

TK^4 9ian flu3t (h)

Hinh ĩ \

Ẳnh bưỏrng cùa các ^ nguồn n i l ư lén sinh ! tftng hợp CVIC—aza ỏr I

Asp.niqer.

1. Cám + NII^NOs ' (1 0g+O.0 2g ; 2. Cảm (NH^Ì, SO4

(ioV+0.ỏ;í3g)Ị 3. Cám + bột bèo dâu

(1 0« + l g ) i 4. Cám

Mặl khác, vl u r ê bị ph ân g i ả i khi k h ử trùng cao áp môi t r ư ờn g nèn à đ â y c'lun^ tòi cbĩ tim hiền ả n h h ư ớ ng cùa bai nguồn nilo (hồng I bường là NH4NO3I

và (NIl4)2S0 4 iên Sinh t ố n g h ợ p CMC-aza ở Asp. niger, Mộl nguồn nilơ hữu cơ tự nhiỏn phd biến lầ bột bèo dàu cũng đ ư ợ c BOs á nh troog thí nghiệm. Kẽt quằ|

ỏ- hinh 2 cho IhSy trèn cả 4 công thức môi t rường, hoại lính enzim đèu đạt cực Ị đại sau 95 giờ nuôi. Tu y o h i t n các ugu d n nitor đèu kích thích i i n h tông h ợ p ( MC—aza t r o n g khoảng t ừ 48 gỉờ đế u 72 giờ.

Một số đặc iính củaCM C—aza à Asp niget.

Nấm m ố c t bường phát Iriền tốt trên các cơ chất rắn nlỉư gỗ, Ciu5ng, rễ '»;'i

á

: u ă l e n z i m t ừ m ẫ n m ố c I h ì v i ệ ' ' l ê n m o n ở t r ạ n g I b á i r ắ n l ầ I h i c h h ợ Ị ) . ở ( ĩ à r

húng tôi lini biẽu một số dẠc tinb lj bổa của CMC—aza cùa Asp nìịịer n uối trên

&m gạo.

I Hình 3 cho I hấv CMC—aza

ỏf Asp. niger hoạ t dộng cựe đại ở pH 4.0. Điều này p hú hợp v ớ i kết quả của lỉ ur st et al,,(1977) Tuy n h i ê n , t r o n g khi enzim ỏr Asp. niger cùa Hurst et al., bền trong phạm vi pll

1 — 9 (V 2;j*c Ihi enzim ở đàv bền ỏf phạ m vi pH hẹ p hơn ( 3 - 5 ) a 3Õ*C.

1. P i i t ỗ i thích : O.ãnilCMC

1 %4 - 1 ml dung dịch enzi m. Gi ữ hỗn Hịch ở các plỉ khác nha u rô) đ ịn h l ượng đ ư ờ n g k hủ .

0.6

ễ

« 0 4 ot ụ

3 4 5 . 6 i

Hình 3. Anh h ư ở n g cèa pll l ê n hoạt tính CMC—aza ờ Asp. niger.

0—7.0. Giữ dịch ở 25®C/24 h rồi chỉnh pH lfri 5 , 0 , Lằng cách thê m ,2M lới thề llch 2 ml Tà xác đ ị n h hoạt tỉnh n h ư trên.

2. Dộ bèn p l l : t r ộ n dịch e nzi m vởi I ml đệrn trên pll (íệm axètat

Hlnb 4. Ẳnh faưỏn£ của n hiệt độ lên hoạt tinh CMC—aza ò Asp. niger.

43

l l * lổi th ic h : 1ml CMC l % - | - 2 m l đệm axẻtat O.IM pH5-f- Iml dịch e n zi m , ủ tr<)n dịch Ò 30®—70*c rồi định l ư ợ n g đưòrng khfr.

2. iìộ b ỉ n n h i ệ l : đưọrc xác định Tổ'! cùng cơ chất, dịch e nzim đ ư ọ c giữ b 3 0 * - 7 0 “C/10mÌQ sau đỏ lầm lạnh Tà xấc định h o9t linh n h ư trên.

Nhiệt độ t6i tliích cho hoạt tinh c ùa CMC—8za à Asp. lìiger Iheo H u r s l e t a l

<1977) là 45®c, nhưng ỏr c h ủ ng của chúng toi u 55*c và enzim bt-n ở (11.4) Một sổ lác giả n h ậ n thẩy NaCI có ảnh h ư ỏ n g lén hoạt tinli của xeniulaza.

Chẳng h ạn Sudư et al (197/) cho biết ờ pll 3,5 xeululaza của pyricularia oryzae đ ư ợ c kich thlch rO rệt: hoại tÍDh của enzim lăng lừ 1,8 — 3 lăn ktii nòng đ ộ NaCl titig tư U.Ol M tởi IM.

«

Thí nghiệm rủa chúDg tôi (H 5) cho thẫy .VaCl kích thích rõ rệt hoạt tinh CMC — aza ở Asp. n i g e r : ờ nồng đ ộ muối

0 , 1 M hoạt tỉnh enzirn đ ạ t c ự c đai và bâng 163% so vời đổii chÚDg.

0.01 o . t , 1.

NaCI I mot.

Hinh 5. Ằnh hưỗTg c ủa NaCl !én Ikoạt linh CMC —« ra ỏr Asp. ỉiiger.

ỏ 0,2ml CMC 1 % 4-0,3 ml đ ệ m a x e t a t dịcli 0,1 M, pH 5-f 1 m l NaCl -t- 0,5ml dịch onrim ủ min rồi định lượnfỉ đ ư ờ n g khử.

Do niiỏi nẵrn t rê n mồi Irirờng đặc nên TÌệc chiốt rúl enzim khỏi cơ c h í t ]à cAn thiết. Duag mổi dùng chiết rút r ó ả n h hưỏrng đén Dồn g đ ộe nzi m. Khỉ chiết i t'it CMC—aza t ừ câm gạo DUÔÍ Trichodrrma vừlde Vilela el at ( t l ) cho biế! chiết rút l)ẵng đ ệm xilrat. 0.05M pH 5.5 clio boạt tinh cnzim eao ntiất to với cbiễt r ú t b-Ằng nước, đ ộ m a x í t a t h a y đ ệ m p h S t pbát. Rết quâ thi ngbỉệm'Vối Asp. aiger {bâng 2) cho thăỵ cbiết rửt eneim bSng đệm axetat đạt hiệu quẳ cao n b £ t

ỉiâng 3. Ánh hưỏ^ng c ãa d u n g m ử i c b ỉ í i r út lên nòng đậ CMC—aza ờ A sp.niger

•nuồi Irên c ảm gạo.

Dung mồi chi^t rủt

Hoại tlnb CxMC—aza

R —r, cin (1) glucổza, m|r/ml

Nưởc 0,50 o . s o

Bộm a ié la ỉ O . l i B , pH 5,0 0,60 0 3 5 Bệm zitffttO.lM', pH 5.0 i 0,r>2 0 . - 5

(1) ninr ở bảnfỊ 1.

Xenliilaza líi phức hệ ciuiin phức lạp. Khi (lũng niróc chiết r ú t cliế phíìm xeiilulaza tliô !ừ Asp.nìger. Ikcda cl al. (1907) <1ã lách được', 4 izòziiii CMC—aza.

Dùng d i ộ n d i l r ô n (Ton poliaoiilam’t ('húníỉtỏi ofinifiiich ( l u ọ c lì r Asp nigcr nuỏf trên o á i n h a i d ả i p r o ’c i n ( t r o n g k h i [ừ 1‘eiucUliưiu s p . c h ì m ộ l ( l â i ) có h o í i t l í n h

C M C - a z a .

TẢI LIỆU THAM KHẢO. CHÍNH

1 Dur;ui, A.. U n i h u r u F a nd Villanueva, J. R. 1973. Morphogenetic a nd nu"

Iritional s udies of 9. laciis c e ' l s . - Arch. Microbiol, 8 8: 245—250.

2. Hurst P.I.,, Nielsen J., Sullivan I\A., s h e p h e r d M.G. 1977. Purification e n d some Pioperlies of Cellulasc from Asp. Iiiger.— Bioclicm. J.. 1()5: 33—41.

3. Ikcd i 1Í.. Yamamoto 'I'., ami Purafsu M. 1973. — Pur ificat ion and some ])hvsical piMp.irties of acid —Cellulasc fr om Asp. niger. — Agric. Biol, cliein 37 ;

l l o 3 - l i 5 y .

4. Kiiiula T., Wakabavashi K., Nisisawa K. 197'). — Purifica!ion and ] T0"

perlics of ÍU1 Kndi>cellulace of Avicellase TvỊ.e f r o m I r pe x lacleus. Bicjchem. .Ỉ, 79: 977-088.

5. Moo-Yoiing M.,Chalial Ds. Vlnch D. 197S SCP f r o m v a r i o u s chemically preireated w o o d siibslrales using Chaclomivin celluiohjiicum. - Biolech. Bioong 20: ’(17-llS.

6. Peilerson N. 1975. Ccllulase and prolein produclion from mixed ciiltu- tcs of TricIiocJeriiia Viride and a Yeast. — Biolech. Bioeng. 17: 1291—1209.

7. IVabachcM. Billaud {’. VÙ Adrian J. 1981 — Valeur alinicn taire d ’ uiie culture (le Asperíỉillus niger. — Sciences des Ailments. 1 : '127 —‘J37.

«. U;i() M., Mishra G. , Secta l i . , Sriiiivasan M.c. , Desl)panclo v . v , 1983 —

l ^ e n i c ’i l U u m . l a n i h i i i e l l i u j i a s i i s o u r c e o f f u n g a l b i o m a s s p r o t e i n f r o m l i g u c c e l -

lulosit.' wasU'. — Ijio'cch. Lett. r>: 301—;i01.

9. Ronssos s., Kaiinbault M. 1982 — Hvdrolyse de la cellulose p s r Ics moi:

Mssiiies. I «. Sc re eni ng » ties souches Gcllulolytiques. — Ann. Microbiol. 133B- 455-161.

10. I' pdegraff D.M. 197Ỉ. Ulili/ation of ccllulose f r o m Wiisle p a p er l)y Wy- rothccium vcrrucaria. — Bioeng. 1 3 : 7 7 —97.

11. Vilela L.C., Torilla A.R., dc Ocampo A.T.. rlcl Rosario K..I. H)77 — Ccllii.

luiC proíiuí^lion in semisolid cultures of Triclioderm:! vilide. — Agric. Biol- Chem. 41: :j;ỉ5 - 2 3 8 .

12. Volfova 0. aad Kyslikova F,. 1979 — Selection o f a Yeast sti'fiin Tvith optimal ulilizalion of s l r a w liydiolysaicz — Fol. Microbiol. 24: 157 —lf;2.

13. Williams A.G. 1983 — Staining rcaclions for the dẹlection of humiccl- l u l o s ) - d e g r a d i n g bacteria. — FEMS. Microbiol. Lcltcrs. 20: 253 -258.

4&

Hryen ZI,nHb Kyai! H flp.

liHOCHHTETHMECKAJI H OH 3H KO- XHM MME CK A3 XAPAKTEPHCTHKA U,E/IJllOJIA3bI ( T H n CMC—A3A) y Aspergillus niger

P e3y;ibTaTbi ncc;ieAOBannii o ốiiociinTeTntiecKOỈl II (ị)H3iiK0 —xHMnqccKoii

x a p a K T e p a c T i i H K a x C M C — a 3 a y A s p n : g c r , K y ^ i b T i i B i i p o B a H H o r o H a i i v ì O T H O i ì c p e A e n o K a 3 b i B a K ) T , HTO H 3 B c e x n p i i p O A H w x U C T OMHHK OB u e . i ; i i o . i o 3 ĩ í a i í c y ố T -

paTbi ốpoxceHiiH TO cMecb piicOBOii OTpyốii IĨ B b i ố p o c ca x a pH o r o TpocHiiKa (OT- HOmCHliC 1:1) ,iaẽT H8M BHCUiyiO aiíTHBHOCTb.

H a c p e ^ e p H C O B O f t O T p y ố H r p n ố h i c n H T e 3 i i p y i 0 T C M C — a s y M a K C H M a . i i > H O y

qcTBẽpTOro ahu.

NH4NO3. (NH^)^ SO4 II MyKS OT Azolla cTiiMy;inpyiOT 0ốpa30Banne ộepMGH- TOB B npOTHH<eHHH OT 48 AO 72 qacOB.

CMC—a3a y Asp. miger noKaauBaCT MaKCHMa;ibHyK) ai<THBHOCTi> npn pH=x4,0 II 5 5 “C, ộepMCHT ốyAÊT ycTOftnuBhiM npn pH = 3,0 —5,0 H SO'C.

N a C l c T i i M > v i H p y e T a K T i i B H O C T b ộ e p M C H T a S K C T p a K u u H C M C — a a a 6 y 4 ) > e p H b i M

pacTBOpoM aueraTa He n;iecCHii pncOBOH oTpyố;ie AaẽT naM BHCUiHft pesyyibTaT- c noMOiuH 9;ieKTpoộope3a ria rcH poliacrilamit 6u;in oổHapyHíCMu j>Ba 6cji. 1

KOBUX no;ioca c aKTHBHOCTbK) C M C —33a. ^I

Ngu3fcn di nb Quyen a o.

BIOSYNTHETIC AND P HY SI CO - CH E MI CA L PROPERTIES OF CEi.LUl.OSE ( C MC- AS E TYPE) FROM ASPERGILLUS NIGEa

s nnc biosvnlhetic a nd Jjhysico—c h e n J r a l properties of CMC—a s6 froim Asp.l niger cultured on solid—stafe medium w e r e studied. It w a s f ound Ihiat n a ­ tural cellulosic soursces used as ferinentiition s ubslr ate s the rice b a n : sugar, cane bagasse (.1,2) mixture gave highest activity. On brail niCiliiitn Asp. riigcri

•ỊiroíUi e i CMC ase ma xi ma ll v a fl er t;t) hours cuzture. N H4NO3, (NiI,)aS>04 and azolhi p o w d e r enhance en^^yaie produclion in (he period f r o m lo 72h culi- vatioii.

C\iCase from Asp. niger s h o w s maximinn aclivilv at pH 4,0 and 05'“C.: pHi a n d hcaii stabilization occurs at pH ÍỈ.0 to 5.0 and 50“C NACL Enhances CMCasej .icliviiy. Exlraclioa of the e n zy me f r o m mould brail w i t h acelate buffer gives;

higtieit efficiency. P ol ya c r y l a m i d e disc gel electrophoretic patlcirn s h o ws Iwo protciu bauds coatainiiig CM(^—saccharifying ability.

Ngàv nhần I0i-i<-I9Hr>