CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Nội dung nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá
44
Phân tích dữ liệu thu được, so sánh với trình tự nucleotide và axit amin tham khảo của ngân hàng Gene Bank.
- Kỹ thuật GAP PCR: Là kỹ thuật sử dụng một mồi xuôi, một mồi ngược gắn ở hai bên ranh giới của cùng DNA đứt gãy, mục đích để phát hiện đột biến mất đoạn toàn bộ gen β-globin.
- Quy trình phát hiện đột biến gen HBB được trình bày trong sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin
45
Tuổi vào viện: 0 – 12 tháng 1 – 5 tuổi 5 – 10 tuổi 10 – 15 tuổi
> 15 tuổi - Giới tính: Nam, nữ
- Dân tộc: Kinh, các dân tộc ít người.
- Địa phương cư trú: Hà Nội, các tỉnh.
2.2.6.2. Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu - Lý do vào viện: Thiếu máu
Vàng da
Kiểm tra sức khỏe
- Tuổi biểu hiện bệnh đầu tiên: Do người nhà phát hiện, phân theo nhóm tuổi như tuổi vào viện.
- Triệu chứng biểu hiện bệnh đầu tiên: Do người nhà phát hiện.
- Triệu chứng khám thực thể khi vào viện: Do nghiên cứu sinh khám.
+ Thiếu máu: Biểu hiện da xanh, niêm mạc nhợt, hemoglobin dưới 120g/l. Đánh giá mức độ thiếu máu dựa vào nồng độ hemoglobin.
+ Vàng da: Khi thấy củng mạc mắt vàng.
+ Lách to: Khi sờ thấy lách dưới bờ sườn trái. Mức độ lách to: 1 – 5 cm là to vừa, từ 5 – 10 cm là lách to nhiều, trên 10 cm là rất to.
+ Gan to: Khi sờ thấy bờ dưới gan dưới bờ sườn phải, từ 1 – 5 cm là gan to vừa, trên 5 cm là to nhiều.
Biến dạng xương, dựa vào khám lâm sàng và X quang xương dài.
Bộ mặt Thalassemia: như hình ảnh hình 1.9, chụp sọ thấy xương sọ dày, có hình chân tóc, đầu to, trán dô, sống mũi tẹt.
Biểu hiện nhiễm sắt: da sạm, niêm mạc lưỡi, lợi chân răng sạm đen.
Xuất huyết dưới da, xuất huyết dạng chấm, nốt, bầm máu dưới da.
46
Đánh giá tăng trưởng: cân nặng, chiều cao, theo chuẩn tăng trưởng người Việt Nam, giảm từ -2SD là chậm tăng trưởng.
Tuổi bắt đầu phải truyền máu: dựa vào hồi cứu tiền sử bệnh, do người nhà cung cấp.
Số lần truyền máu/năm: dựa vào y bạ và người nhà cung cấp.
- Phân loại thể lâm sàng theo mức độ bệnh: Theo phân loại của Hiệp hội Thalassemia quốc tế 2003 [113] như bảng sau:
Bảng 2.1. Phân loại lâm sàng thalassemia
Thể nặng Thể trung gian Thể nhẹ
* Lâm sàng Tuổi
Lách to Vàng da
Biến dạng xương Bộ mặt thalassemia
< 2 tuổi ++++ (rất to)
+++ (Rõ) ++++ (Rõ) ++ → ++++
(Vừa → rõ)
> 2 tuổi +++ → ++++
(to vừa → rất to) + → +++
(Nhẹ → rõ) ++ → ++++
(vừa → rõ) 0 → +++
(không → rõ)
Không triệu chứng.
Thiếu máu nhẹ 0 → + (Không to, hơi to)
0 0 0
* Huyết học Hemoglobin (g/dl) MCV (pg)
HbF (%) HbA2 (%)
5-7
< 75
> 50
> 4
7 – 10
< 75 10 – 50
>4
> 10 – 12
< 75 0 – 10
> 3,5
* Bố, mẹ Cả hai mang
gen với HbA2
> 3,5%
Một hoặc cả hai mang gen
HbA2 > 3,5% hoặc có Hb khác
* Di truyền phân tử
kiểu đột biến. Nặng Nhẹ/Ẩn Nhẹ/Ẩn
Vì Thalassemia trung gian là một nhóm thalassemia rộng, mức độ nặng của bệnh rất khác nhau, giữa β-thalassemia nặng đến β-thalassemia nhẹ. Để có thể phân tích kỹ hơn, chúng tôi phân loại β-thalassemia trung gian thành 3 nhóm nhỏ khác nhau, theo phân loại của Shubba R.Phadke đề xuất như sau [114].
47
Bảng 2.2. Thang điểm phân loại β-thalassemia trung gian dựa vào lâm sàng và diễn biến bệnh
Kiểu hình Điểm
1. Tuổi biểu hiện bệnh Dưới 6 tuổi
6 – 15 tuổi Trên 15 tuổi
2 1 0 2. Hemoglobin trung bình (g/dl)
6 – 7.5 7,5 – 9,5
> 9,5
2 1 0 3. Chậm tăng trưởng (chiều cao dưới bách phân vị 3)
Có
Không 2
0 4. Bộ mặt Thalassemia
Rõ Nhẹ Không
2 1 0 5. Tuổi truyền máu đầu tiên
< 6 tuổi 6 – 15 tuổi
> 15 tuổi
Không phải truyền máu
3 2 1 0 6. Số lần truyền máu/năm
≥ 2
1 hay < 1 lần/ năm Không
2 1 0 Nhóm I: 0 – 2 điểm
Nhóm II: 3 – 6 điểm Nhóm III: 7 – 13 điểm
2.2.6.3. Đặc điểm về cận lâm sàng - Huyết học:
* Số lượng hồng cầu (T/l)
* Số lượng Hemoglobin (g/l)
48
Thiếu máu nhẹ: Hb: 91 – 120 g/l Thiếu máu vừa: Hb: 60 – 90 g/l Thiếu máu nặng: Hb: < 60 g/l
* Hematocrit (%)
* MCV (fl): Hồng cầu nhỏ khi MCV <80fl, to khi MCV > 120 fl.
* MCH (pg): Hồng cầu nhược sắc khi MCH < 27 pg.
* RDW: càng lớn, kích thước hồng cầu càng to nhỏ không đồng đều.
* Số lượng bạch cầu (G/l) giảm khi < 5 G/l, tăng khi > 12 G/l.
* Số lượng tiểu cầu (G/l) giảm khi <50 G/l, tăng khi > 300 G/l.
* Thành phần Hb (%): HbA1
HbA2
HbF
Hb khác
- Sinh hóa:
* Ferritin: ng/dl
* Sắt huyết thanh: mg/dl
* Chức năng gan: SGOT, SGPT đơn vị /dl
* Chức năng thận: Ure, Creatinin mg/dl 2.2.6.4. Đột biến gen β-globin
* Số mẫu phát hiện đột biến
* Các đột biến phát hiện, xếp theo thứ tự phổ biến
* Phân bố các đột biến theo phân loại của Hiệp hội Thalassemia quốc tế:
- Phân bố theo vị trí đột biến Vùng khởi động
Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2
- Phân bố đột biến theo chức năng gen:
49
Đột biến phiên mã,
Đột biến tiến trình hoàn thiện RNA Đột biến dịch mã RNA
- Phân bố đột biến theo kiểu gen : đồng hợp tử, dị hợp tử kép, dị hợp tử phối hợp với Hb khác.
- Phân bố đột biến theo dân tộc
* Liên quan giữa kiểu gen – kiểu hình lâm sàng, huyết học, bằn cách : - Đối chiếu các đột biến với thể bệnh lâm sàng.
- Đối chiếu các đột biến với mức độ bệnh.
- Đối chiếu kiểu gen đột biến với mức độ bệnh,
- Đối chiếu kiểu gen – kiểu hình lâm sàng thể nặng và trung gian,.
- Đối chiếu kiểu gen với các chỉ số hồng cầu thể nặng và trung gian,.
- Đối chiếu kiểu gen với thành phần hemoglobin thể nặng và trung gian.