Các phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của noãn và phôi

Chẩn đoán phôi trước làm tổ (PGD/ preimplantation genetic diagnosis) là một kỹ thuật dùng để phát hiện những bất thường về chất liệu di truyền của phôi tạo ra trong ống nghiệm trước khi chuyển phôi vào buồng tử cung. Chẩn đoán trước làm tổ được chỉ định khi hoặc bố mẹ hoặc cả hai đã biết là có bất thường về di truyền và xét nghiệm được tiến hành trên phôi để xem phôi có mang bất thường về di truyền hay không.

Ngược lại, sàng lọc trước làm tổ (PGS/ preimplantation genetic screening) được chỉ định khi phôi tạo ra từ cặp vợ chồng được xem là bình thường về nhiễm sắc thể được kiểm tra xem có bị lệch bội nhiễm sắc thể hay không.

Hiện nay có rất nhiều phương pháp di truyền học phân tử để đánh giá nhiễm sắc thể của con người, dưới đây là những kỹ thuật đã được kiểm chứng và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực điều trị hỗ trợ sinh sản.

1.4.1. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescent in situ hybridization/FISH).

Phương pháp này được dùng để phát hiện hoặc định vị sự có mặt hay không của một đoạn DNA nào đó trên nhiễm sắc thể. Trong phương pháp FISH người ta sử dụng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu cho trạng thái của nhiễm sắc thể gắn kết với một đoạn nhiễm sắc thể có tần suất diễn biến cao.

Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để xem đầu dò huỳnh quang đó bám vào nhiễm sắc thể nào sẽ là chỉ báo trạng thái của nhiễm sắc thể đó.

Phương pháp FISH được sử dụng lần đầu tiên để xét nghiệm phôi người vào năm 1992 [36]. Từ đó, hàng trăm ngàn bệnh nhân làm thụ tinh trong ống nghiệm đã được sàng lọc phôi bằng phương pháp này. Sau một thời gian ứng dụng nhiều nghiên cứu đã cho thấy giảm tỷ lệ sẩy thai, tăng tỷ lệ thai làm tổ và tỷ lệ sinh sống khi chuyển các phôi được sàng lọc bằng phương pháp này.

Mặc dù phương pháp FISH đã được cải tiến và góp phần làm tăng hiệu quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm nhưng còn khiếm khuyết quan trọng trong chẩn đoán là chỉ kiểm tra được một lượng giới hạn nhiễm sắc thể (tối đa là 12 cặp nhiễm sắc thể) nên tỷ lệ chẩn đoán âm tính giả cao.

Một điểm hạn chế nữa của phương pháp này là kỹ thuật thực hiện khó, đòi hỏi kinh nghiệm khi cố định và dàn trải một phôi bào ra phiến kính. Điều này không phải ở bất kỳ trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm nào cũng có người thực hiện được kỹ năng thao tác nói trên [37].

1.4.2. Phương pháp lai so sánh bộ gen (comparative genomic hybridization/CGH).

Phương pháp lai so sánh bộ gen là một phương pháp di truyền tế bào phân tử dùng để phân tích đánh giá những thay đổi trong quá trình sao chép về số lượng (nhiều/ít) trong thành phần DNA của mẫu được xét nghiệm.

Cùng một lúc phương pháp có thể kiểm tra được toàn bộ nhiễm sắc thể trong một tế bào ở bất cứ giai đoạn phân chia nào mà không cần kỹ thuật cố định tế bào. Trong phương pháp này, sử dụng kỹ thuật lai so sánh/đối chiếu của DNA cần xét nghiệm đã được đánh dấu màu xanh với DNA của nhiễm sắc thể bình thường sử dụng làm chứng được đánh dấu màu đỏ. Tỷ lệ giữa phần huỳnh quang xanh/ phần huỳnh quang đỏ dọc theo nhiễm sắc thể thể hiện số lượng nhiễm sắc thể của mẫu thử với mẫu chứng. Nếu màu huỳnh quang xanh đặc hiệu cho nhiễm sắc thể tăng dư ra chứng tỏ có tăng thêm nhiễm sắc thể (thể tam nhiễm), trái lại nếu màu huỳnh quang đỏ tăng dư ra là biểu hiện thiếu nhiễm sắc thể. Phương pháp này được áp dụng lần đầu tiên trên phôi người vào năm 1996 [38].

Ứng dụng phương pháp CGH để tầm soát phôi đã phát hiện ra sự đa dạng và tần suất rối loạn nhiễm sắc thể của phôi, đã khẳng định rằng tất cả các nhiễm sắc thể của phôi đều có thể bị rối loạn trong giai đoạn trước khi làm tổ. Một số rối loạn chưa từng được phát hiện trong chẩn đoán trước sinh nay đã phần nào sáng tỏ và được coi là nguyên nhân dẫn đến phôi ngừng phát triển, không làm tổ hoặc sảy ở giai đoạn rất sớm.

Phương pháp CGH cũng có thể phát hiện được những bất thường mà phương pháp FISH không thể phát hiện được, ví dụ như đứt đoạn nhiễm sắc thể [39]. Một điểm hạn chế về lâm sàng của phương pháp CGH là độ phức tạp của kỹ thuật và trả lời kết quả chậm phải sau 4 ngày.

1.4.3. Phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA (array –comparative genomic hybridization/a-CGH).

Gần đây, một phương pháp đơn giản hơn và cho kết quả nhanh hơn đã được phát triển từ phương pháp CGH là phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA (a-CGH). Nguyên lý của phương pháp này cũng gần giống như phương pháp CGH nhưng có độ nhạy cao hơn, kỹ thuật thao tác đơn giản và nhanh hơn.

Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong chẩn đoán tiền làm tổ từ năm 2004 [40]. Năm 2010, phương pháp này đã được kiểm chứng xác minh và được ứng dụng trong điều trị lâm sàng phục vụ chẩn đoán tiền làm tổ ở một số nước tân tiến như Hoa kỳ và châu âu [41],[42].

1.4.4. Phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotide dùng chíp DNA (array Single Nucleotide Polymorphism /a-SNP).

Phương pháp này cũng có thể đánh giá được cả 23 cặp nhiễm sắc thể dựa trên việc phân tích đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism /SNP). Đa hình đơn nucleotide (SNP) là một chuỗi DNA biến đổi xảy ra khi nucleotide đơn A, T, C hoặc G - trong bộ gen khác nhau giữa các thành viên của một loài sinh học hoặc cặp nhiễm sắc thể trong một cá thể.

Chíp SNP được tạo bởi các đoạn DNA gọi là oligonucleotide, nó có khả năng phân biệt sự thay đổi của các SNP và vì vậy đem lại thông tin về di truyền của một tế bào.

1.4.5. Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain reaction/PCR).

Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) được dùng để chẩn đoán rối loạn của một gen, bao gồm cả rối loạn gen lặn và gen trội. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase còn được gọi là phương pháp nhân lên DNA (DNA amplification). Khi cần phân tích một đoạn DNA nào đó, người ta

dùng kỹ thuật này để nhân lên đoạn DNA đó, tạo ra nhiều bản sao của phân tử ADN đó rất nhanh chóng để phân tích được dễ dàng và chính xác.

1.4.6. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing/NGS).

Công nghệ này thực tế là phương thức giải trình tự đồng thời và lượng lớn các đoạn ngắn nucleotide. Phương pháp này được kỳ vọng là làm giảm giá thành chi phí sàng lọc trước làm tổ và có độ chính xác cao. Phương pháp này bắt đầu được áp dụng rộng rãi ở một số nước châu Âu và Mỹ từ năm 2014 để phân tích nhiễm sắc thể của phôi nang.