Quy trình nghiên cứu

 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu, thu thập các chỉ số nghiên cứu, thu thập mẫu nghiên cứu

- Các đối tượng đủ tiêu chuẩn lựa chọn được khai thác thông tin theo bệnh án nghiên cứu mẫu (Phụ lục 1).

+ 2ml máu toàn phần chống đông bằng EDTA được thu thập từ 220 bệnh nhân ung thư phổi tại Trung tâm hô hấp và Trung tâm y học hạt nhân và ung bướu Bệnh viện Bạch mai, 230 người mạnh khỏe làm đối chứng.

+ Bảo quản mẫu trong tủ lạnh âm sâu (t^o= -80^oC) cho đến khi phân tích mẫu.

 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

- Tách chiết DNA toàn phần: theo kit Promega (Phụ lục 2)

- Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy Nanodrop. Kết quả OD của mẫu DNA được coi là đạt khi nồng độ từ 20 ng/µl trở lên. Với những mẫu có nồng độ DNA quá cao >300 ng/µl sẽ được pha loãng để đưa về nồng độ < 100 ng/µl. Độ tinh sạch của DNA được đo bằng tỷ số A260/A280 và mẫu DNA tinh sạch khi tỷ số này từ 1,8-2,0.

- Điện di DNA trên gel agarose để kiểm tra sự toàn vẹn của DNA.

 Xác định các đa hình gen TP53 và gen MDM2

- Sử dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53 (Phụ lục 3)

+ Khuếch đại vùng gen chứa intron 3 gen TP53 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1).

+ Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 3 % cùng với thang chuẩn 100→1000 (Phụ lục 4).

+ Hình ảnh điện di nếu có thêm đoạn 16bp sẽ có kích thước 135bp so với đoạn gen nguyên thuỷ 119bp. Kiểu gen A1A1 sẽ chỉ có 1 băng 119bp, kiểu gen A1A2 sẽ có hai băng 119bp và 135bp, kiểu gen A2A2 sẽ có một băng với kích thước 135bp.

Hình 2.1. Mô tả hình ảnh điện di xác định đa hình gen do thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53

- Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – PCR) xác định SNP R72P của gen TP53 (Phụ lục 5).

+ Khuếch đại vùng gen chứa SNP Arg72Pro của gen TP53 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1).

+ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10l) gồm: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O.

+ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94^oC - 5 phút, 35 chu kỳ 94^oC - 30 giây, 55^oC - 30 giây, 72^oC - 30 giây), 72^oC - 5 phút. Bảo quản mẫu ở 15^oC.

+ Phân tích RFLP: sản phẩm PCR được ủ với enzym giới hạn BstUI ở điều kiện 37^oC qua đêm (18-22 giờ). Sản phẩm cắt được điện di cùng với thang chuẩn 100bp trên gel agarose 2%. Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. Đoạn gen được nghiên cứu chứa trình tự nhận biết của enzyme BstUI (CGCG) tại vị trí codon 72.

Khi BstUI cắt đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước 165 bp và 231 bp, tương ứng với kiểu allele Arg (wild type-GG). Khi base G bị thay thế bởi base C sẽ làm mất trình tự nhận biết của enzyme BstUI, do đó đoạn gen sẽ không bị cắt, tương ứng với kiểu allele Pro (mutant type-CC). Kiểu gen đồng hợp R72R có hai băng 165 và 231. Kiểu gen dị hợp R72P có 3 băng 165, 231 và 396 bp. Kiểu gen đồng hợp P72P chỉ có một băng 396 bp (Hình 2.2).

Hình 2.2: Xác định kiểu gen R72P bằng kỹ thuật PCR-RFLP + Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự trực tiếp.

- Phân tích SNP309 của gen MDM2 bằng phương pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism - PCR) (Phụ lục 5).

+ Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen MDM2 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1).

+ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10μl) gồm: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μM mồi xuôi và mồi ngược, 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O.

+ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94^oC/5 phút, 35 chu kỳ 95^oC/30 giây, 55^oC/30 giây, 72^oC/30 giây), 72^oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15^oC.

+ Kỹ thuật RFLP: Sản phẩm PCR được ủ với enzym cắt giới hạn MspA1i ở điều kiện 37^oC qua đêm (18-22 giờ). Sản phẩm cắt được điện di cùng với thang chuẩn 100bp trên gel agarose 3%. Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system.

Đoạn gen được nghiên cứu chứa trình tự nhận biết của enzym MspA1i (CCG↓CTG) tại vị trí SNP309. Bình thường vị trí SNP309 của gen MDM2 là T, không chứa vị trí nhận biết của enzym MspA1i, đoạn gen được khuếch đại không bị cắt và giữ nguyên kích thước 157bp, tương ứng với kiểu allele T (wild type-TT). Khi có sự thay thế base T bởi base G sẽ xuất hiện trình tự nhận biết của enzym MspA1i, do đó đoạn gen bị cắt và tạo ra các đoạn DNA có kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng với kiểu allele G (mutant type-GG).

Kiểu gen đồng hợp TT có một băng duy nhất 157 bp. Nếu hình ảnh điện di có 3 băng 157, 109 và 48 bp, tương ứng với kiểu gen dị hợp GT. Nếu kết quả có 2 băng 109 bp và 48 bp thì tương ứng với kiểu gen đồng hợp GG (Hình 2.3).

Hình 2.3: Xác định kiểu gen SNP309 gen MDM2 bằng kỹ thuật PCR-RFLP

+ Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự trực tiếp.

- Phân tích các SNP P34P, P36P, P47S, V217M, G360A gen TP53 bằng phương pháp giải trình tự (Phụ lục 6, 7).

+ Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP P34P, P36P, P47S, V217M, G360A bằng phương pháp PCR

 Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi, 1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O.

 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94^oC/5 phút, 33 chu kỳ 94^oC/30 giây, 60^oC/30 giây, 72^oC/30 giây), 72^oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15^oC.

+ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose kiểm tra, sau đó được tiến hành giải trình tự theo quy trình thường quy.

+ Kết quả được so với trình tự Genebank.

Bảng 2.1. Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các SNP [91], [92], [93], [94], [95].

STT Đa hình gen Trình tự mồi

Sản phẩm PCR

(bp) 1

Dup16bp intron

3-TP53

F: 5′-TGGGACTGACTTTCTGCTCTT-3′

R: 5′-TCAAATCATCCATTGCTTGG–3′

135 hoặc 119 2 R72P-TP53 F: 5’-CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG-3’

R: 5’-ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG-3’ 396 3

SNP309-MDM2

F:5’-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3’

R:5’-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3’ 157

4

P34P, P36P, P47S

(exon 4-TP53)

F: 5’-CAACGTTCTGGTAAGGACAA-3’

R: 5’-GCCAGGCATTGAAGTCTCAT-3’ 511

5

V217M- (exon

6-TP53)

F: 5’-AGCGCTGCTCAGATAGCGAT -3’

R: 5’-TAAGCAGCAGGAGAAAGCCC -3’ 181

6

G360A- (exon 10-TP53)

F: 5’-GCTGTATAGGTACTTGAAGTGC -3’

R: 5’-CTGTGGATACACTGAGG CAAG -3’ 433

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu