Quy trình phân tích gen BTK

 Sơ đồ quy trình phân tích gen

Quy trình tiến hành phân tích gen BTK tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, bệnh viện Nhi Trung Ương theo các bước sau:

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình xác định đột biến gen BTK gây bệnh XLA

 Kỹ thuật tách ADN tổng số từ máu ngoại vi

- Quy trình tách ADN tổng số từ máu ngoại vi được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit tách ADN (Qiagen-DNA blood mini kit).

- Sau khi tách ADN, tiến hành xác định nồng độ ADN tổng số để tính toán thành phần phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt.

- Phương pháp điện di ADN theo quy trình để thu được ADN tinh sạch và đảm bảo nồng độ ADN phù hợp (phụ lục 3).

 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger bằng máy ABI 3130 Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gen BTK

- Gen BTK gồm 19 exon được chia thành 9 đoạn nhỏ như hình 2.3

Hình 2.4. Sơ đồ nhân đoạn gen BTK

- Phản ứng PCR khuếch đại 19 exon của gen BTK bao gồm các thành phần:

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Thể tích /mẫu (µl)

PCR multiplex master mix 2X 25

Primer 10X 5

dH20 15

DMSO (10%) 3

ADN 2

Tổng thể tích 50

- Trình tự mồi: được thực hiện theo quy trình tại khoa Di truyền – bệnh viện Nhi Trung Ương - phụ lục 4.

- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại:

95^oC 5 phút 94 ^oC 30 giây

58 ^oC 1 phút 30 chu kỳ

72 ^oC 2 phút 72 ^oC 5 phút

- Phản ứng PCR khuếch đại được thực hiện trên máy PCR Eppendoff (Eppendoff, Đức).

- Kết quả quy trình: sau mỗi chu kỳ phản ứng, từ 1x đoạn ADN cần nhân sẽ có 2x đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn ADN mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn ADN được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi.

Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại.

Kiểm tra sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose bằng phương pháp điện di. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch của QIAGEN (QIAquick PCR Purification Kit, Đức) trước khi tiến hành giải trình tự gen.

Phản ứng PCR mồi đơn

- Trình tự đoạn gen quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn ADN một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các dNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại dNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng hoá chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã

có chứa sẵn các hoá chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự

như dNTPs, DNA polymerase…Do đó chỉ cần bổ sung thêm ADN khuôn (là sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp. Trình tự mồi và các thành phần phẩn ứng PCR mồi đơn theo phụ lục 5.

Chu trình nhiệt của phản ứng mồi đơn như sau:

96 ^oC 1 phút 96 ^oC 10 giây

50 ^oC 05 giây 25 chu kỳ

60 ^oC 4 phút Giữ lạnh ở nhiệt độ 4⁰C

Tinh sạch sản phẩm PCR mồi đơn: phản ứng PCR mồi đơn sau khi được tiến hành xong sẽ được tinh sạch bằng kit tinh sạch của ABI (BigBye X Terminator v3.1 cycle sequencing kit) để chạy giải trình tự gen.

Giải trình tự gen bằng máy ABI PRISM 3130 tại khoa Di truyền và sinh học phân tử, bệnh viện Nhi Trung Ương: sản phẩm PCR mồi đơn sau khi được tinh sạch bằng kít BigDye X-terminator v3.1 cycle sequencing kit được sử dụng để giải trình tự gen trực tiếp trên máy ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer machine (Applied Biosystem, Hoa Kỳ).

Các cặp mồi được thiết kế bởi trung tâm Gen, Bệnh viện Queen Mary, Hồng Kông.

Xử lý số liệu và phân tích đột biến trên gen BTK.

- Các trình tự gen được thu thập bằng phần mềm Sequencing analysis v3.1 và phân tích trên phần mềm Chromas để chắc chắn rằng trình tự mồi xuôi và mồi ngược của mỗi exon có thể ghép được hoàn toàn với nhau. Trình tự thu được sẽ được ghép nối thành trình tự của gen BTK bằng phần mềm ChromasPro v2.1.8 và đưa lên chương trình Blast để so sánh với trình tự

chuẩn GenBank U78027.1.

- Đột biến đã công bố được viết theo đúng danh pháp quốc tế

“Sequence Variant Nomenclature” (http://varnomen.hgvs.org) và so sánh với dữ liệu được công bố trên thế giới Human Gen Mutation database (HGMD - http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php) và nguồn dữ liệu đột biến gen mở

Leiden (LOVD) (http://www.lovd.nl/3.0/home).

- Các đột biến (novel mutation) chưa được công bố sẽ tiếp tục được so sánh với các dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế và phân tích để dữ đoán liệu đột biến đó là đột biến gây bệnh (mutation) hay chỉ là một đột biến đa hình (polymorphism).

 Kỹ thuật Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) - Kỹ thuật MLPA dựa trên nguyên lý của sự kết nối đa mồi-probe lai với vùng gen đích, mà vùng gen này thường có kích thước lớn, tiếp theo là chạy PCR định lượng sử dụng cặp mồi PCR universal-tag cho tất cả các cặp probe, rồi sau đó là phân tích đoạn. Theo cách thức này MLPA có thể phát hiện các mất đoạn và nhân đoạn xảy ra trong vùng gen phân tích, là một phương pháp chẩn đoán thay thế có giá trị, hoặc là phương pháp bổ sung cho kỹ thuật giải trình tự

gen khi khảo sát các đột biến mất đoạn đã biết hoặc chưa biết của bệnh XLA.

Đối với bệnh XLA, Probe MRC Holland SALSA P210 được thiết kế để phát hiện những thay đổi về số bản sao của 29 trình tự khác nhau trong vùng gen

BTK, chủ yếu được sử dụng để phát hiện các đột biến xóa đoạn, lặp đoạn của một hoặc nhiều trình tự, trong hoặc gần vùng gen BTK. Các đột biến mất đoạn dị hợp tử sẽ có các đầu tín hiệu giảm từ 35-50% so với mức bình thường.

- Hỗn hợp đầu dò trong kit MLPA bao gồm 19 đầu dò cho 19 exon của gen BTK. Ngoài ra, hỗn hợp đầu dò này còn bao gồm 10 đầu dò đặc hiệu cho bộ gen người để làm mẫu đối chứng, 1 đầu dò đặc biệt cho nhiễm sắc thể X và 2 đầu dò đặc biệt cho nhiễm sắc thể Y (UTY gene). Kit MLPA được thiết kế để sàng lọc các mất đoạn, lặp đoạn của một hoặc nhiều exon trên gen BTK.

Sự mất đoạn sẽ được biểu hiện bằng hình ảnh các đỉnh (peak) không xuất hiện so với mẫu đối chứng bình thường.

+ Quy trình phân tích MLPA: phụ lục 6.

+ Phân tích kết quả MLPA bằng phần mềm Coffalyser.