CHUYÊN SAN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP - LÂM NGHIỆP - Y DƯỢC

(1)

Tập 164, số 04, 2017

Tập 164, Số 04, 2017

(2)

T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ

CHUYÊN SAN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP - LÂM NGHIỆP - Y DƯỢC

Môc lôc Trang

Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Thị Lân - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cây trồng xen đến sinh trưởng và năng suất của giống dong riềng DR3 tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 3 Nguyễn Viết Hưng, Lê Thị Kiều Oanh, Hoàng Kim Diệu, Nguyễn Thị Trang - Nghiên cứu khả năng sinh

trưởng, phát triển của một số giống bí đỏ tại Thái Nguyên năm 2015 9

Lê Thị Kiều Oanh, Trần Văn Điền, Trần Đình Hà, Trần Trung Kiên - Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của một số giống đậu xanh trong vụ Hè Thu năm 2015 tại Thái Nguyên 15 Hà Đình Nghiêm, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thị Huệ - Quản lý cây trinh nữ móc (Mimosa diplotricha) bằng mô hình dự đoán phân bố, mức độ xâm lấn và sử dụng sinh khối để trồng nấm 21 Nguyễn Thị Lân, Nguyễn Thế Hùng - So sánh, lựa chọn giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ mùa tại

thành phố Sơn La, tỉnh Sơn La 27

Nguyễn Thị Tuyên, Nguyễn Việt Hưng - Phương pháp phòng trừ mối hại gỗ trong các công trình xây dựng

thuộc Đại học Thái Nguyên 33

Nguyễn Hải Hòa, Trần Thị Phương Thúy, Dương Trung Hiếu, Nguyễn Thị Thu Hiền - Sử dụng ảnh SPOT 6 xây dựng bản đồ sinh khối và trữ lượng các bon rừng trồng thông thuần loài tại xã Nguyên Bình, huyện Tĩnh Gia,

tỉnh Thanh Hóa 39

Nguyễn Việt Hưng, Nguyễn Thị Tuyên - Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ lá xoan trong bảo quản gỗ 47 Đặng Minh Tơn, Đặng Văn Minh, Nguyễn Văn Toàn - Các loại đất chính, phân bố và tính chất trên địa bàn

vùng cam Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang 53

Nông Thị Huyền Chanh, Hoàng Hữu Chiến - Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt động khai thác cát sỏi đến biến động sử dụng đất nông nghiệp trên địa bàn xã Hợp Thịnh, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang 61 Triệu Mùi Chản, Chu Văn Trung, Đỗ Sơn Tùng, Nguyễn Đình Thi, Nguyễn Thảo Yến, Bùi Thị Hường, Hoàng Đông Quang - Xây dựng hệ thống lập quy hoạch kế hoạch sử dụng đất bán tự động 67 Nguyễn Văn Lợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi chất lượng của quả vải thiều sau thu hoạch 75 Phạm Thị Phương, Nguyễn Thị Đoàn, Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Thị Nhung, Lưu Hồng Sơn - Nghiên cứu hiệu quả bảo quản của compozit của chitosan khối lương phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản đào Pháp 81 Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân, Nguyễn Văn Quang, Phan Thị Hồng Phúc, Lê Minh, Phạm Diệu Thùy, Trần Nhật Thắng, Dương Thị Hồng Duyên - Xác định serotype, độc lực và tính kháng kháng sinh của 3

loại vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh 87

Nguyễn Thị Thúy Mỵ, Trần Thanh Vân, Đỗ Thị Kiều Duyên - Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm Mfeed⁺ đến sức sản xuất thịt của gà F1 (ri x Lương Phượng) nuôi nhốt tại Thái Nguyên 97 Từ Trung Kiên, Trần Thị Hoan, Nguyễn Văn Sơn- Ảnh hưởng của bổ sung dầu hạt lanh vào khẩu phần đến

năng suất và chất lượng trứng gà Isa shaver 103

Trương Hữu Dũng, Nguyễn Thị Hằng, Phùng Đức Hoàn - Đánh giá khả năng sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn của 3 tổ hợp lợn lai thương phẩm (DP x CA); (PD x CA) VÀ (LP x CA) giai đoạn sơ sinh đến 56 ngày tuổi 109 Sử Thanh Long, Nguyễn Công Toản, Trần Văn Vũ - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian mang

thai của bò sữa nuôi tại xí nghiệp bò Phù Đổng, Hà Nội 115

Trần Thị Hoan, Từ Trung Kiên, Nguyễn Thị Hiền - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay thế thức ăn viên hỗn hợp bằng cỏ Ghinê (panicum maximum) trong khẩu phần đến hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất của

thỏ thịt New Zealand 121

Journal of Science and Technology

164 (04)

N¨m

2017

(3)

Vũ Khánh Linh, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Lâm, Lương Hùng Tiến - Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật phân giải cellulose hướng tới tạo ra chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 133 Vũ Hoài Nam, Dương Văn Cường - Tăng cường sinh tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli tái tổ hợp được

bổ sung một phần con đường mevalonate 141

Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường, Cao Thị Phương Thảo - Sử dụng mã vạch DNA để định loại loài Màn

màn vàng (Cleome viscosa L.) ở Việt Nam 147

Trịnh Đình Khá, Lý A Hù, Đặng Duy Phong, Nguyễn Hữu Quyền, Hoàng Thị Thiên Hương - Tổng hợp nano bạc bằng dịch chiết lá đào Prunus persica và hoạt tính kháng khuẩn của nó 153 Nguyễn Thị Thu Hà, Chu Thị Na, Cao Thị Phương Thảo - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu một số

loài cây cảnh hạn sinh thuộc họ thuốc bỏng (Crassulaceae) 157

Phạm Thị Mỹ, Hoàng Thị Mai, Vi Đại Lâm, Dương Mạnh Cường - Thử nghiệm điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn phân giải nitơ phân lập từ một số mẫu nước tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 165 Hoàng Thị Lan Anh, Dương Thị Minh Hòa - Nghiên cứu ứng dụng mô hình lọc tái tuần hoàn nước thải khu ký túc xá Trường Đại học Nông Lâm bằng sét Kabenlis 3 171 Dương Hữu Lộc, Nguyễn Xuân Vũ, Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm - Đặc điểm nông sinh học và mối quan hệ di truyền của một số giống quýt (Citrus Recutilata Blanco) tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 177 Đinh Thị Huyền Chuyên, Sỹ Danh Thường, Trịnh Đình Khá, NguyễnThị Yến - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và hoạt tính kháng khuẩn của loài màn màn vàng thu thập ở tỉnh Thái Nguyên 183 La Việt Hồng, Trần Hồng Thu, Phạm Thị Quy, Đinh Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Ngọc Khánh - Xác định chỉ thị phân tử và tái sinh chồi in vitro của loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll ex

Hemsl.) thu tại Sa pa - Lào Cai 189

Nguyễn Hải Linh, Ma Diệu Quỳnh, Ma Thị Thu Lệ, Bùi Thị Thu Thủy, Vũ Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hồng Hạnh - Cao cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.) có tác dụng hỗ trợ điều trị béo phì trên chuột nhắt trắng 195 Lê Phong Thu, Nguyễn Thu Thủy, Tạ Văn Tờ - Tổng quan đáp ứng mô bệnh học ung thư vú sau điều trị hóa

chất tiền phẫu 201

Hà Trọng Quỳnh - Lượng giá thiệt hại sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm không khí tại phường Tân Long, thành

phố Thái Nguyên 207

Nguyễn Thị Trung - Nghiên cứu khả năng nhận biết đặc hiệu các kháng nguyên của Listeria monocytogenes của

một số kháng thể đơn dòng nhằm sử dụng trong tạo que thử nhanh 215

(4)

La Việt Hồng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 189 - 193

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ TÁI SINH CHỒI IN VITRO

CỦA LOÀI HOÀNG TINH HOA ĐỎ (Polygonatum kingianum Coll ex Hemsl.) THU TẠI SA PA - LÀO CAI

La Việt Hồng^1*,Trần Hồng Thu¹,Phạm Thị Quy¹, Đinh Phương Thảo¹, Nguyễn Thị Thanh¹,Phạm Ngọc Khánh²

1 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2,

2 Trạm Nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa, Viện Dược liệu

TÓM TẮT

Cây Hoàng tinh hoa đỏ là một trong những dược liệu trong y học cổ truyền. Trong nghiên cứu này, mẫu Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa - Lào Cai được phân loại ở mức độ loài qua đặc điểm hình thái và xác định hai trình tự psbA-trnH và rpoC1của loài này để làm chỉ thị phân tử. Tiếp đó, quy trình tạo vật liệu khởi đầu và tái sinh chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ đã được xây dựng nhằm bảo tồn loài này. Kết quả cho thấy trên đối tượng loài Hoàng tinh hoa đỏ, trình tự psbA-trnH có chiều dài 616 bp dùng để phân loại và nhận dạng ở mức độ loài, trình tự rpoC1 có chiều dài 542 bp dùng để phân loại và nhận dạng đến mức độ Chi. Trong quá trình tạo mẫu sạch in vitro, chồi non được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% (v/v)/15 phút và javen 10% (v/v)/15 phút. Môi trường MS, 30 g/l đường saccharose, 7 g/l agar có bổ sung 5 mg/l BAP và 0,2 mg/l IAA là thích hợp nhất để tái sinh chồi in vitro của cây Hoàng tinh hoa đỏ. Đây là lần đầu tiên cây Hoàng tinh hoa đỏ được tái sinh chồi in vitro, kết quả này hứa hẹn để bảo tồn cây thuốc này trong tương lai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.

Từ khóa: Chỉ thị, Phân tử, Hoàng tinh hoa đỏ, in vitro, SaPa

MỞ ĐẦU ^*

Loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl.) là loại cây thuốc quý được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền phương Đông với tên vị thuốc “Thục hoàng” [14]. Loài Hoàng tinh hoa đỏ thuộc Chi Polygonatum, họ Măng tây (Convallariaceae). Trên thế giới, chi Polygonatum có 60 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới từ dãy Himalaya đến Nhật Bản, Bangladesh, Myanmar, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan và Malaysia. Ở Anh có 3 loài đặc hữu; ở Trung Quốc có 32 loài, trong đó có 20 loài là đặc hữu có ở Trung Quốc trong đó có loài Hoàng tinh hoa đỏ. Ở Nước ta, cây Hoàng tinh hoa đỏ (tên gọi khác củ cơm nếp, Hoàng tinh vòng) được ghi nhận chủ yếu ở Lai Châu, Điện Biên, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Yên Bái, Cao Bằng [6]. Hoàng tinh hoa đỏ thuộc nhóm EN A1c,d [6], hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [5]. Tuy nhiên, trong những năm qua, nguồn dược liệu Hoàng tinh trong nước đứng trước

*Tel:0973.376.668; Email: laviethong.sp2@gmail.com

nguy cơ cạn kiệt do bị khai thác bừa bãi, hiện chưa có biện pháp ngăn chặn hữu hiệu. Do đó, nhiều nguồn gen dược liệu có nguy cơ cạn kiệt, tuyệt chủng trong hệ thực vật Việt Nam, trong đó có các loại Hoàng tinh. Hiện nay, kỹ thuật DNA barcoding là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa. Kỹ thuật này thường sử dụng các đoạn trình tự đặc trưng như psbA-trnH,ITS, rpoC1, matK… [8], [10], [11]. Việc xác định loài bằng kỹ thuật này có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [9]. Xuất phát lý do trên, chúng tiến hành nghiên cứu chỉ thị phân loại phân tử bổ sung và tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. góp phần bảo tồn nguồn gen loài này.

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu thực vật

Mẫu được thu tại Trạm Nghiên cứu Trồng cây thuốc Sa Pa - Lào Cai (Viện Dược liệu).

(5)

190

Phương pháp nghiên cứu Thu thập mẫu và nhận dạng loài

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu để xác định loài, tên khoa học dựa vào các tài liệu phân loại thực vật.

Xác định hai trình tự psbA-trnH và rpoC1:

DNA từ lá Hoàng tinh hoa đỏ được tách chiết bằng phương pháp CTAB và tinh sạch. DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại hai trình tự psbA-trnH và rpoC1 này lần lượt là:

01_F:5’-

GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’, 01_R:5’-

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’;

02_F:5’-

GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’;

02_R:5’CCATAAGCATATCTTGAGTTGG- 3’.

Chu trình nhiệt: 94ôC/ 4 phút; 30 chu kỳ x (94ôC/ 30 giây; 54ôC/ 30 giây; 72ôC/ 45 giây);

72^oC/ 10 phút. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và được xác định trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Trình tự DNA được xử lý và phân tích bằng phần mềm Bioedit, DNA star và BLAST của NCBI [13].

Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ Tạo vật liệu khởi đầu: Củ Hoàng tinh hoa đỏ chứa chồi non được rửa sạch, ngâm trong nước xà phòng loãng 20 - 30 phút và rửa kỹ dưới vòi nước chảy. Sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 70⁰ trong 15 - 30 phút, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch javen 3 - 40% (v/v) trong 15 - 30 phút. Cuối cùng, mẫu được rửa lại 4 lần bằng nước cất khử trùng. Chồi non Hoàng tinh hoa đỏ được cấy lên môi trường cơ bản gồm MS, 30 g/l saccharose, 8 g/l agar.

Theo dõi tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch - sống, tỉ lệ mẫu sạch - chết sau 5-7 ngày.

Tái sinh chồi in vitro: Các chồi sạch được chuyển sang môi trường MS có bổ sung BAP (6-benzylaminopurine), BAP kết hợp với IAA (Idol acid acetic). Cụ thể: BAP (1; 2; 3; 5; 8

mg/l); BAP (1;2; 3; 5 mg/l) kết hợp IAA nồng độ 0,2 mg/l. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu phát sinh chồi (%), số chồi/mẫu (chồi), chiều cao chồi (cm), số lá/chồi (lá) và đặc điểm chồi tái sinh sau 6 tháng nuôi cấy.

Phân tích thống kê: Số liệu được thu thập và xử lí thống kê bằng chương trình Excel 2010 [4]. Sai khác giữa các công thức được kiểm tra bằng phương pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất - LSD0,05 với α = 0,05. Giá trị thể hiện trong các bảng số liệu là giá trị trung bình.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đặc điểm phân loại loài Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa (Lào Cai)

Đặc điểm hình thái

Loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls.) thuộc loại cây thân rễ sống lâu năm. Thân rễ mọc ngang, phình lên thành củ màu vàng hay trắng, trên củ có các vết sẹo của thân khí sinh. Thân cây mọc đứng, cao 50 – 80 cm. Lá không có cuống, mọc vòng trên các đốt thân; phiến lá hình mác, dài 7 – 12 cm, rộng 0,5 - 1,2 cm; chóp lá nhọn và quăn. Hoa mọc ở kẽ lá, cuống hoa dài 1,5 – 2 cm, mỗi cuống mang hai hoa hình ống, dài 8 – 15 mm, màu đỏ tím. Quả mọng, hình cầu đường kính 7 – 10 mm, khi chín màu tím đen [1], [2], [3], [7], [12].

Hình 1. Mẫu cây thu tại Sa Pa-Lào Cai.

(A): Toàn bộ cây, (B): Lá cây mọc vòng, hoa màu đỏ Trong nghiên cứu này, mẫu được thu tại Sa Pa (Lào Cai) được thể hiện ở Hình 1. Dựa trên đặc điểm hình thái so sánh cho thấy mẫu thu tại Sa Pa (Lào Cai) chính là loài Hoàng tinh hoa đỏ, có tên khoa học Polygonatum kingianum Coll ex Hemsl.

(6)

Chỉ thị phân loại phân tử

Kết quả phân lập và xác định trình tự psbA-trnH được thể hiện ở Hình 2.

Hình 2. So sánh trình tự psbA-trnH (kí hiệu HTHD_Sapa_01) thu từ cây Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa và của loài P.kingianum (Mã số trên Genbank: KJ745828.1).

Phân tích Hình 2 cho thấy, trình tự psbA-trnH của loài P.kingianum thu tại Sa Pa - Lào Cai có chiều dài là 616 bp, có độ tương đồng 99%

với trình tự psbA-trnH (Mã số: KJ745828.1) của loài P.kingianumvới chiều dài 622 bp đã công bố trên Genbank. Như vậy, trình tự psbA-trnH phân lập được là đặc trưng cho loài P.kingianum, có thể dùng để phân loại và nhận dạng loài này. Tiến hành phân tích tương tự đối với trình tự rpoC1, kết quả cho

thấy trình tự rpoC1 phân lập được từ loài Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa - Lào Cai có chiều dài 542 bp và có độ tương đồng 99%

với trình tự rpoC1của nhiều loài thuộc chi Polygonatum như P.sibiricum (KT695605.1), P.verticillatum (KT722981.1), P.cyrtonema (KT630835.1)… Như vậy, trình tự rpoC1của các loài thuộc Chi Polygonatum không có sự khác biệt, do đó chỉ sử dụng trình tự này để nhận dạng cho Chi này.

Hình 3. Tạo vật liệu khởi đầu và tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ (A): Củ cây Hoàng tinh hoa đỏ chứa chồi non. (B): Mẫu chồi sạch-vô trùng.

(C-H): Chồi in vitrosau 6 tháng nuôi cấy, C: BAP 1,0 mg/l, D: D: BAP 2,0 mg/l, E: BAP 5,0 mg/l, F: BAP 2 mg/l+IAA 0,2 mg/l, G: BAP 3 mg/l+IAA 0,2 mg/l MS, H: BAP 5 mg/l+IAA 0,2 mg/l.

(7)

192

Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ Tạo vật liệu khởi đầu

Chồi non thu từ củ Hoàng tinh hoa đỏ (Hình 3A) được sử dụng làm nguồn mẫu. Kết quả cho thấy nồng độ thích hợp nhất để khử trùng bề mặt chồi non là cồn 70% trong thời gian 15 phút, dung dịch javen 10% trong thời gian 15 phút, cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất là 50% (Hình 3B). Các mẫu này được nuôi cấy để tái sinh chồi.

Tái sinh chồi in vitro

Kết quả tái sinh chồi cây Hoàng tinh hoa đỏ in vitro được thể hiện ở Hình 3 (C-H) và Bảng 1 và Bảng 2.

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi in vitro

Bảng 1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi (sau 6 tháng nuôi cấy) BAP (mg/l) Mẫu phát

sinh chồi (%)

Số chồi/mẫu (chồi)

Chiều cao chồi

(cm) Số lá/chồi (lá) Đặc điểm chồi tái sinh (*)

ĐC-0 33,3 1,00â 2,32â 2,50â Kém

1 100 1,25^a 4,11^d 3,75^b Tốt

2 100 3,00^b 3,55^c 2,75^ab Tốt

3 100 1,75^a 2,95^b 2,00^a Trung bình

5 100 1,25^a 3,20^b 1,75^a Trung bình

8 0 - - - -

(*) Tốt: chồi mập, lá xanh; Trung bình: chồi bình thường, lá xanh nhạt; Kém: chồi gầy, lá xanh nhạt, (-) Không có phản ứng, các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α

= 0,05. Kí hiệu dùng cho các bảng.

Kết quả nghiên cứu trong Bảng 2 cho thấy môi trường có nồng độ 2 mg/l BAP có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tạo chồi, số chồi đạt được là 3 chồi/mẫu, số lá đạt được là 2,75lá/chồi, chiều cao chồi đạt 3,55cm.

Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng nhân chồi in vitro

Bảng 2. Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng tạo chồi (sau 6 tháng nuôi cấy) Chất điều tiết sinh trưởng Mẫu phát

sinh chồi (%)

Số chồi/mẫu (chồi)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/chồi (lá)

Đặc điểm chồi tái sinh BAP (mg/l) IAA (mg/l) (*)

ĐC 0,0 33,3 1,00â 2,32â 2,50â Kém

1 0,2 0,0 - - - -

2 0,2 100 1,25^ab 3,13^b 2,00^a Kém

3 0,2 100 2,25^bc 3,35^b 2,75^a Trung bình

5 0,2 100 3,00^c 4,20^c 4,75^b Tốt

Kết quả tại Bảng 2 cho thấy ở công thức BAP 5 mg/l + IAA 0,2 mg/l cho chiều cao chồi, số lá/chồi lần lượt là 4,2 cm và 4,75 lá/chồi, và cao hơn rõ rệt so với thí nghiệm chỉ dùng BAP đơn lẻ chỉ đạt 3,55 cm và 2,75 lá/chồi.

KẾT LUẬN

Loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl.) thu tại Sa Pa-Lào Cai được bổ sung thêm hai chỉ thị phân loại phân tử là psbA-trnH vàrpoC1 có chiều dài

lần lượt 616 bp và 542 bp, có thể sử dụng trình tự psbA-trnH để nhận dạng loài này trong khi trình tự rpoC1 để nhận dạng mức độ Chi Polygonatum. Chồi non trên thân rễ cây Hoàng tinh hoa đỏ được khử trùng bằng cách rửa bằng nước sạch, khử trùng trong cồn 70%

(v/v)/15 phút và javen 10% (v/v)/15 phút.

Môi trường tái sinh chồi MS, 3% đường saccharose, 0,7% agar có bổ sung 5 mg/l BAP và 0,2 mg/l IAA thích hợp nhất để tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro.

(8)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Võ Văn Chi, (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, tập I, tr. 1119-1120.

2. Phạm Hoàng Hộ, (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, Nxb Trẻ, tr. 483-484.

3. Đỗ Tất Lợi (1996), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 4. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội tr.

179-194.

5. Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ.

6. Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (2007), Sách đỏ Việt Nam, phần II. Thực vật – tr. 388 (Vietnam red data book, Part II. Plants), Nxb Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

7. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 960-963.

8. Chase M. W., Cowan R. S., Hollingsworth P.

M., et al (2007), “A proposal for a standard

protocol to barcode all land plants”, Taxon, 56, pp.

295-299.

9. Gonzalez M. A., Baraloto C., Engel J., Mori S.

A., Pétronelli P. (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10), p. 7483.

10. Kress W. J., Wurdack K. J., Zimmer E. A., Weigt L. A., Janzen D. H. (2005a), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 102, pp. 8369-8374.

11. Kress W. J., Wurdack K. J., Zimmer E. A., Weigt L. A., Janzen D. H., (2005b), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 102(23), pp. 8369–8374.

12. Zheng-Yi W., Raven P. H. (2003),

“Flagellariaceae through Marantaceae”, Flora of China, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, 24, pp. 223 – 233.

13. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

14. http://www.vncreatures.net

SUMMARY

DETERMINATION OF MOLECULAR MARKERS AND REGENERATION OF IN VITRO SHOOTS OF Polygonatum kingianum Coll ex Hemsl.

La Viet Hong^1*,Tran Hong Thu¹, Pham Thi Quy¹, Dinh Phuong Thao¹, Nguyen Thi Thanh¹, Pham Ngoc Khanh²

1Hanoi Pedagogical University N⁰2

2 Sapa Center for planting medicinal plant, National Institute of Medicinal materials

Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. is an important medicinal material in traditional medicine. In this study, Explants of Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. were collected from SaPa-Lao Cai and classified at species level through anatomical characteristics and two molecular markers of this species including psbA-trnH and rpoC1 were sequenced. After that, in vitro shoots of P. kingianum were regenerated from young shoots of rhizome for multiplication to conserve this species. The result showed that the first sequence, psbA-trnH, had 616 bp and was a good marker for identification at species level. The second sequence, rpoC1, had 542 bp and was useful to classify Polygonatum genus. Young shoots of rhizome were suface sterilized in 70% (v/v) ethanol for 15 minutes, in 10% (v/v) javel (Sodium hypochlorite) solution for 15 minutes. The medium including MS, 30 g/l saccharose, 7 g/l agar and supplemented with 5 mg/l BAP and 0.2 mg/l IAA was suitable for in vitro shoots regeneration. For the first time, in vitro shoots regeneration of Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. was established, this result is potential for the convervation of medicinal material in the future.

Keywords: Marker, Molecular, Polygonatum kingianum, in vitro, Sapa

Ngày nhận bài: 07/4/2017; Ngày phản biện: 10/4/2017; Ngày duyệt đăng: 27/4/2017

*Tel:0973.376.668; Email: laviethong.sp2@gmail.com