KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BẮT GỐC TỰ DO DPPH, ABTS CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM LINH CHI ĐEN (AMAURODERMA) THU
HÁI TẠI TỈNH ĐẮK LẮK
Lê Văn Cơ, Nguyễn Thị Xuân San, Nguyễn Thị Thanh, Ngũ Trường Nhân* Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Trường Đại học Tây Nguyên
*Email: ngutruongnhan@gmail.com
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Nấm linh chi đen (Amauroderma) là nguồn cung cấp nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị cao trong lĩnh vực sản xuất chất kháng oxi hoá, tuy nhiên có rất ít nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS từ nấm linh chi đen aroderma. Mục tiêu: định tính sự hiện diện của các nhóm chất và thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá, khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS của 8 loại cao chiết từ 04 loài nấm Amaroderma. Đối tượng và Phương pháp: Điều chế cao chiết, điều chế cao phân đoạn. Phương pháp định tính được thực hiện theo mô tả của Sofowora (1996) và Tiwari (2013). Khả năng bắt gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Marsden Blois (1958) Khả năng bắt gốc tự do ABTS được xác định theo phương pháp của Re và cộng sự (1999). Kết quả: xác định được sự hiện diện của các nhóm chất alkaloid, polyphenol, steroid, terpenoid, saponin, polysaccharid. Trong thử nghiệm xác định khả năng kháng oxi hoá, cao ethanol và cao nước toàn phần của 04 loài nấm này có khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS cao hơn so với các cao chiết từ nấm G.lucidum. Cao chiết ethanol của nấm A.niger có khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS tốt nhất (IC50 lần lượt là 200 µg/mL và 110,16 µg/mL). Trong 5 cao phân đoạn của cao ethanol A.niger, nhóm hợp chất polyphenol (phenolic và flavonoid) tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat thì khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS của cao phân đoạn ethyl acetat là cao nhất trong với các giá trị IC50 lần lượt là 99,0181 µg/mL và 11,95 µg/mL. Kết luận: nghiên cứu đánh dấu một tiềm năng mới trong tìm kiếm hoạt chất kháng oxi hóa của một số loài nấm Amaroderma mọc tại địa bàn tỉnh Đắk Lắk.
Từ khóa: Nấm Amauroderma, kháng oxi hóa, gốc tự do DPPH, gốc tự do ABTS, hợp chất polyphenol.
ABSTRACT
SCAVENGING ACTIVITY AGAINST DPPH, ABTS FREE RADICALS TO EVALUATE ANTIOXIDANT POTENTIALS OF SOME EXTRACTS FROM
AMAURODERMA IN DAK LAK PROVINCE
Le Van Co, Nguyen Thi Xuan San, Nguyen Thi Thanh, Ngu Truong Nhan Natural Science and Technology Faculty, Tay Nguyen University Background: Black linzhi mushroom (Amaurodermar) is novel biosource of natural product for antioxidant agents. No previous studies have reported on chemical constituents and bioactivities of Amaroderma species. Objectives: study on phytochemical investigation and DPPH and ATBS for evaluation of antioxidant activity on Amauroderma extract collected in Đak Lak province. Material and methods: usage methods in this study by Sofowora (1996), Tiwari (2013), Marsden Blois (1958), Re et al (1999). Results: we observed that all Amauroderma extracts were showed positive evidence of alkaloid, polyphenol, steroid, terpenoid, saponin, polysaccharide compounds. Scaveging of free radicals by DPPH and ATBS for evaluation of antioxidant activity, 8 extracts from 04 Amaroderma species were showed antioxidant activity stronger than G.lucidum extracts. The ethanol extract of A.niger was showed the strongest antioxidant activity with IC50
200 µg/mL and 110,16 µg/mL for DPPH and ATBS, respectively. The ethyl acetate extract fraction of A.niger showed strong positive evidence of polyphenol compounds (phenolic and flavonoid compounds). Fraction extract was observed the strongest antioxidant activity in 5 fraction extracts
of A.niger ethanol extract with IC50 99,0181 µg/mL and 11,95 µg/mL for DPPH and ATBS, respectively. Taken together, we summarised that the antioxidant potential of A.niger may come from polyphenol compounds. Conclusion: our work first demonstrates a new antioxidant approach of natural compounds from Amaroderma in Đak Lak province.
Key words: Amauroderma, antioxidant, free radical of DPPH, free radical of ABTS, polyphenol.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Khi tuổi cao, môi trường sống bị ô nhiễm hay bị stress, cơ thể con người sẽ sản sinh nhiều gốc tự do hơn các chất chống oxi hoá, một sự mất cân bằng có thể dẫn đến tổn thương các thành phần tế bào như lipid, protein và DNA. Suy thoái tế bào cuối cùng dẫn đến mất một phần và toàn bộ chức năng của các hệ sinh lý trong cơ thể, lúc này chất chống oxi hoá để điều trị thoái hóa tế bào bắt đầu được có nguồn gốc từ thiên nhiên được chú ý [1].
Trong những năm gần đây nhiều hợp chất có hoạt tính dược lý từ nấm linh chi đã được phát hiện và phân lập mang lại các tác dụng như: kháng sinh, chống oxi hóa, kháng virus, chống dị ứng, chống miễn dịch, kháng viêm, hoạt động bảo vệ gan... [2]. Trong các khảo sát về tính hiệu quả của các phương pháp xác định khả năng kháng oxi hoá thì hai phương pháp được xem như tiêu chuẩn xác định khả năng kháng oxi hoá là phương pháp DPPH và ABTS [3]. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, chi phí thấp, cho kết quả nhanh thường được sử dụng để đánh giá khả năng kháng oxi hóa tổng thể của mẫu khảo sát [4]. Phương pháp bắt gốc tự do ABTS là phương pháp nhạy và ổn định hơn được sử dụng ở các môi trường có pH khác nhau và thường được sử dụng để đánh giá khả năng kháng oxi hóa của nhóm hợp chất polyphenol [5].
Theo Thần nông bản thảo trong họ nấm linh chi (Ganodermataceae) dựa vào màu sắc có 6 loại nấm linh chi (đỏ, xanh, vàng, trắng, đen và tím). Nấm linh chi là cây thuốc quý thường được sử dụng tăng cường sức khoẻ cho người. Hiện nay, nấm linh chi được sử dụng nhiều ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới trong trong việc phòng và chữa nhiều bệnh (tăng cường sức đề kháng cơ thể, chữa các bệnh liên quan đến gan, đường hô hấp, tim mạch, huyết áp, bệnh liên quan đến hệ thần kinh, và cả trong lĩnh vực làm đẹp, ngăn ngừa lão hoá…). Theo các nghiên cứu của Lê Xuân Thám, Nguyễn Phương Đại Nguyên và cộng sự [6, 7]. Tây Nguyên là vùng có số lượng lớn nấm linh chi (thuộc họ Ganodermataceae bao gồm 2 chi Amauroderma và Garnoderma) phong phú và đa dạng.
Các kết quả của nghiên cứu này tập trung theo hướng phân tích sự đa dạng về thành phần loài, vùng phân bố, chưa nghiên cứu các hoạt tính sinh học của nấm linh chi. Do vậy, việc khảo sát một số hợp chất và khả năng bắt gốc tự do DPPH, ABTS của cao chiết từ một số loài Amauroderma thu hái tại tỉnh Đắk Lắk là thiết thực và có ý nghĩa.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Mẫu nấm các loài: Amauroderma subresinosum (A. subresinosum); Amauroderma niger (A. niger); Amauroderma exile (A. exile); Amauroderma sp (A. sp) và Ganoderma lucidum (được sử dụng làm mẫu đối chứng dương) thu hái vào tháng 3/2017 tại các khu vực trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk đã được định danh và lưu trữ tại Bộ môn Sinh học cơ sở – Trường Đại học Tây Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết
Quả thể của mẫu nấm nghiên cứu được loại bỏ tạp chất (cỏ, đất, vỏ cây) sấy khô và xay nhỏ. Sau đó các mẫu này được cân xác định khối lượng và ngâm vào dung môi ethanol và nước chiết theo tỉ lệ 1/10 ở nhiệt độ khoảng 400C theo phương pháp ngâm kiệt để thu dịch chiết. Sau đó dịch chiết được cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không và sấy bằng máy sấy thăng hoa đến khi khô hoàn toàn thu cao chiết. Các cao chiết được bảo quản ở điều kiện lạnh trong tủ cấp đông.
Lựa chọn cao chiết có tiềm năng kháng oxi hóa cao nhất xác định khối lượng và hòa tan hoàn toàn vào nước cất 2 lần tạo dung dịch cao chiết. Dung dịch này được hoà tan bằng hexan, để yên 30 phút cho hỗn hợp dung dịch phân lớp, thu lớp hexan và đem cô đuổi dung môi thu được cao chiết phân đoạn hexan. Lặp lại quá trình với các dung môi lần lượt là chloroform, ethyl acetat và butanol. Các cao phân đoạn được bảo quản trong điều kiện lạnh trọng tủ cấp đông.
2.2.2 Phương pháp định tính sơ bộ hóa học
Phương pháp định tính được thực hiện theo mô tả của Sofowora (1996) [8] và Tiwari (2013) [9] với 8 cao chiết nồng độ 100 mg/mL được định tính với các thuốc thử.
Các bước thực hiện đã mô tả trong tài liệu.
Bảng 1. Xác định sự hiện diện của một số nhóm hợp chất có trong các cao chiết và phân đoạn từ các mẫu nấm nghiên cứu
Nhóm chất Cách thực hiện/Phương pháp Hiện tượng quan sát Alkaloid 2 ml cao chiết + 2 ml thuốc thử Mayer Kết tủa trắng
Flavonoid 1 ml dịch chiết + 10mg bột magie + 3 - 5 giọt sulfuric 10%
Màu vàng
Phenolic + tanine 2 ml cao chiết + 2-3 giọt FeCl3 5% Kết tủa màu xanh đen Steroid 2ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử
Liebermann-Burchard
Màu xanh nhạt, xanh lục, hồng, cam hay đỏ bền
Terpenoid 2 ml cao chiết + 10 giọt thuốc thử Trim Hill
Mặt phân cách xuất hiện màu xanh dương, xanh lục, màu tím hoặc màu đỏ
Acid hữu cơ 2ml cao chiết + 0.1g tinh thể NaCO3 Bọt khí nổi lên trong dung dịch Saponin 5ml cao chiết lắc mạnh trong 30 giây Lớp bọt khí bên trên dung dịch có độ
bền từ 5 đến 60 phút Polysaccharide 3ml cao chiết + 1ml phenol + 7ml
H2SO4
Ủ dung dịch trong bể điều nhiệt 400C trong vòng 30 phút; Trung hòa dung dịch bằng NaOH đến pH7, thêm 1ml thuốc thử Orcinol-Sulfuric acid ủ dung dịch trong bể điều nhiệt ở 1000C trong 5 phút.
Nâu nhạt, tím, xanh, nâu đỏ
2.2.3. Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
Khả năng bắt gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Marsden Blois (1958) [10]. Các chất kháng oxi hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH tự do tạo thành sản phẩm khử DPPH-H, dung dịch phản ứng sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng cam, làm giảm độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 517nm.Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxi hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức: I% = [(Ao-As) / Ao] × 100%. (Ao: giá trị mật độ quang của mẫu trắng; As: giá trị mật độ quang của mẫu thử)
2.2.4. Xác định khả năng quét gốc tự do ABTS
Khả năng bắt gốc tự do ABTS được xác định theo phương pháp của Re và cộng sự (1999) [20Error! Reference source not found.]. Cation ABTS++ [2,2’-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate] là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chưa ABTS++, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734nm so với mẫu đối chứng để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa. Khả năng bắt gốc tự do ABTS của một cao chiết (hoặc chất chống oxi hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức: I% = [(Ao-As) / Ao]
× 100%. (Ao: giá trị mật độ quang của mẫu trắng; As: giá trị mật độ quang của mẫu thử).
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao chiết toàn phần
Các nhóm hợp chất có trong cao chiết các loài nấm khảo sát được sử dụng các phương pháp định tính đặc trưng cho từng hợp chất. Kết quả xác định được trình bày ở bảng 1 và 2.
Bảng 1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất trong các cao ethanol của các loài loài nấm nghiên cứu.
Nhóm chất A.subresinosum A.niger A.exile A.sp G.lucidum
Alkaloid +++ ++ +++ ++ ++
Flavonoid + + + + +
Phenolic ++ + + + +
Steroid + ++ ++ + +
Terpenoid + - + - ++
Acid hữu cơ ++ + + + +
Saponin + + + + +
Polysaccharide ++ ++ ++ ++ ++
(+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rất rõ;
(-): phản ứng âm tính
Bảng 2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất trong cao nước của các loài nấm nghiên cứu.
Nhóm chất A.subresinosum A.niger A.exile A.sp G.lucidum
Alkaloid + + + + +
Flavonoid + ++ + + +
Phenolic + + + + +
Steroid + + + + +
Terpenoid - - - - +
Acid hữu cơ + + + + +
Saponin ++ +++ ++ ++ ++
Polysaccharide +++ +++ ++ ++ +++
(+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rất rõ;
(-): phản ứng âm tính
Kết quả xác định sự có mặt của các chất trong cao phân đoạn được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất trong cao phân đoạn từ cao ethanol của mẫu A.niger.
Nhóm chất Hexan Chloroform Ethyl acetate n-Butanol nước
Alkaloid + + + + -
Flavonoid + + ++ + +
Phenolic + ++ ++ ++ -
Steroid ++ ++ ++ + +
Terpenoid ++ ++ + + -
Acid hữu cơ + + + + +
Saponin + + + + ++
Polysaccharide + + + + ++
(+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rất rõ;
(-): phản ứng âm tính
3.2. Kết quả xác định khả năng kháng oxi hóa của cao cao ethanol và cao nước toàn phần
Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol và cao nước toàn phần
Phương pháp bắt gốc tự do DPPH là một trong những phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa in vitro tổng thể cho mẫu nghiên cứu. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết thô được thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 4. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết thô Nồng độ
(mg/mL)
% Khả năng bắt gốc tự do DPPH
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Cao ethanol A.
subresinosum 32,18±1,666g 47,46±0,622g 63,87±0,617e 70,13±0,620g 78,48±0,151g A. niger 34,63±0,277h 50,95±0,111h 65,9±0,15f 75,72±0,378h 88,85±0,167h A. exile; 30,29±0,278f 43,92±0,671f 60,58±0,436d 66,84±0,435f 74,85±1,442f A. sp 25,81±0,533e 35,79±1,188e 46,18±2,272c 53,25±0,378d 59,38±0,377d G.lucidum 7,09±0,081 12,02±0,124 18,14±0,562 23,26±0,509 34,19±0,278
Cao nước toàn phần A.
subresinosum 11,95±0,073a 19,46±0,446b 31,15±1,203b 41,17±0,476a 50,5±0,475a A. niger 19,09±0,386d 30,41±0,625d 46,68±0,510c 55,97±0,369e 62,34±0,309e A. exile; 17,41±0,132c 26,82±1,329c 31,34±0,091b 44,71±0,110c 58,43±0,831c A. sp 13,09±0,081b 18,02±0,124a 23,14±0,562a 43,26±0,509b 54,19±0,278b G.lucidum 5,09±0,081 10,02±0,124 14,14±0,562 21,26±0,509 28,19±0,278
Hình 3.1. Giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết thô so với mẫu đối chứng (vitamin C và G.lucidum)
a – l: biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết thô với độ tin cậy 95% (p<0.05)theo phân hạng Duncan.
Khả năng bắt gốc tự do ABTS của cao ethanol và cao nước toàn phần
Phương pháp bắt gốc tự do ABTS là một trong những phương pháp được đánh giá cao để khảo sát khả năng thu nhận gốc tự do của hợp chất phenolic [4]. Khả năng bắt gốc tự do ABTS của các mẫu cao chiết từ 4 mẫu nấm khảo sát được thể hiện qua bảng 5.
Bảng 5. Khả năng bắt gốc tự do ABTS của cao ethanol và cao nước toàn phần Nồng độ
(μg/mL)
Khả năng bắt gốc tự do ABTS (%)
100 200 300 400 500
Cao ethanol
A.subresinosum 42,45±1,737c 61,99±1,736c 67,51±1,736c 78,29±1,737c 87,76±0,182c A.niger 47,08±0,109d 63,19±0,109d 69,19±0,109d 81,79±0,109d 92,31±0,109d A.exile 30,90±0,524b 36,47±0,526b 49,56±0,521b 65,65±0,526b 76,74±0,524b A.sp 25,79±0,050a 34,31±0,052a 44,34±0,050a 60,96±0,050a 74,14±0,050a G.lucidum 4,80±0,332 6,49±0,328 17,66±0,332 27,74±0,331 41,16±0,332
Cao nước toàn phần
A.sub 7,80±0,332a 15,49±0,328a 27,66±0,332a 39,74±0,331a 51,16±0,332a A.niger 18,56±0,636d 27,58±0,636d 40,16±0,640d 52,69±0,639d 62,77±0,640d A.exile 15,27±0,932c 25,35±0,932c 36,93±0,932c 50,01±0,930c 60,05±0,932c A.sp 9,46±0,372b 18,93±0,371b 31,60±0,37b 44,83±0,372b 53,30±0,372b G.lucidum 5,60±0,332 8,29±0,328 16,37±0,332 21,24±0,331 31,20±0,332 Ghi chú: a – d biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về % khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao chiết ethanol với độ tin cậy 95% (p<0,05)theo phân hạng Ducan.
Hình 3. 2 Khả năng bắt 50% gốc tự do ABTS của cao chiết thô
Ghi chú: a – h biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao chiết thô với độ tin cậy 95% (p<0,05) theo phân hạng Ducan
Kết quả xác định khả năng kháng oxi hóa của cao phân đoạn từ cao ethanol của mẫu A.niger
Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao phân đoạn từ cao ethanol của mẫu A.niger Kết quả xác định hoạt tính kháng oxi hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH của các phân đoạn được thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6 Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của các phân đoạn Nồng độ
(μg/mL) Phân đoạn
% Khả năng bắt gốc tự do DPPH
100 200 300 400 500
Hexan 21,73±0,994a 32,99±2,394b 45,91±0,434b 54,82±0,482b 61,91±1,477b Chloroform 25,02±1,652b 38,70±1,079c 52,04±1,110c 62,33±0,299c 69,55±0,091c Etylacetat 49,39±0,186d 61,57±2,605e 73,80±0,266e 82,46±0,467e 95,24±0,123e n-Butanol 29,46±1,212c 44,87±0,872d 57,61±0,869d 67,80±1,455d 72,25±0,074d Nước 21,39±4,516a 31,22±1,218a 43,25±0,948a 50,53±1,079a 57,47±0,918a Ghi chú: a –e biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về giữa % khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn ở những nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95%
(p<0,05) theo phân hạng Ducan.
Hình 3.3.1 Khả năng bắt 50% gốc tự do DPPH của các phân đoạn của cao ethanol từ mẫu nấm A.niger
Ghi chú: a – f biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về giữa các giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn ở những nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95% (p<0,05) theo phân hạng Ducan.
Khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao phân đoạn từ cao chiết ethanol của mẫu nấm A.niger
Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao phân đoạn được thể hiện ở bảng 7.
Bảng 7. Phần trăm bắt gốc tự do ABTS của các phân đoạn từ cao chiết ethanol của mẫu nấm A.niger
Nồng độ (μg/mL) Phân đoạn
% Khả năng bắt gốc tự do ABTS
100 200 300 400 500
Hexan 22,57±0,260a 31,26±0,261a 38,72±0,260a 43,90±0,261a 52,79±0,261a Chloroform 33,33±2,925c 44,16±2,925c 55,96±2,925c 67,77±2,928c 78,42±2,925c Etylacetate 59,25±0,440e 68,14±0,439e 79,05±0,440e 89,89±0,440e 99,00±0,811e n-Butanol 40,15±0,447d 56,02±0,445d 67,74±0,447d 78,00±0,449d 85,90±0,445d Nước 29,4±0,455b 38,29±0,457b 47,97±0,458b 53,80±0,457b 58,78±0,457b Ghi chú: a – e biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về giữa % khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao phân đoạn ở những nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95%
(p<0,05) theo phân hạng Ducan.
Hình 3. 4 Khả năng bắt 50% gốc tự do ABTS của các phân đoạn
Ghi chú: a – f biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do ABTS của các cao phân đoạn ở những nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95% (p<0,05) thoe phân hạng Ducan.
IV. BÀN LUẬN
4.1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cao chiết toàn phần
Từ bảng 3.1 cho thấy, cao chiết ethanol từ các mẫu nấm trong nghiên cứu đều cho kết quả dương tính với hầu hết các nhóm hợp chất thử nghiệm. Trong đó, cao chiết ethanol của mẫu nấm A.subresinosum cho kết quả dương tính mạnh với nhóm alkaloid, phenolic, acid hữu cơ và polysaccharide, kết quả dương tính yếu với các nhóm còn lại. Cao chiết ethanol của ba mẫu nấm (A.niger, A.exile, A.sp) cho kết quả dương tính mạnh tập trung vào nhóm alkaloid, steroid, polysaccharide. Ở mẫu đối chứng (Ganoderma lucidum) cho kết quả dương tính mạnh ở nhóm alkaloid, terpenoid và polysaccharide.
Từ bảng 3.2 cho thấy, cao chiết bằng nước từ các mẫu nấm trong nghiên cứu đều cho kết quả dương tính với hầu hết các nhóm hợp chất thử nghiệm. Trong đó, cao chiết ethanol của các mẫu nấm này cho kết quả dương tính mạnh với nhóm saponin và polysaccharide, kết quả dương tính yếu với các nhóm còn lại. Từ những kết quả của thí nghiệm này cho thấy, dung môi nước chiết tập chung các chất thuộc nhóm polysaccharide và saponin, dung môi ethanol có khả năng thu nhận được nhiều nhóm hợp chất hơn.
Dựa vào các kết quả của các thí nghiệm trên, 4 mẫu nấm nghiên cứu có tiềm năng bắt tốt gốc tự do ABTS. Trong đó cao chiết cồn của hai mẫu (A.subresinosum và A.niger) cho thấy có giá trị IC50 không khác biệt nhau về mặt thống kê, nhưng giá trị IC50 của A.niger (110,16μg/mL) thấp hơn so với A.subresinosum. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn cao chiết ethanol của A.niger trong thử nghiệm kế tiếp.Từ bảng 3.3 cho thấy, mức độ hiện diện của các nhóm chất trong cao chiết phân đoạn khác nhau. Phân đoạn hexan tập trung chủ yếu nhóm chất steroid và terpenoid. Phân đoạn chloroform và ethyl acetat là các nhóm hợp chất polyphenol và steroid. Phân đoạn nước là nhóm saponin và polysaccharide.
4.2. Kết quả xác định khả năng kháng oxi hóa của cao ethanol và cao nước toàn phần 4.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao ethanol và cao nước toàn phần
Kết quả ở bảng 3.4 trên cho thấy, khi tăng dần nồng độ cao chiết thì khả năng bắt gốc tự do DPPH cũng tăng lên ở các mẫu nấm nghiên cứu. Điều này chứng tỏ các cao
chiết thô của các mẫu nấm khảo sát đều chứa các chất kháng oxi hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, nhưng sự thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa ở các cao chiết thô là khác nhau. Căn cứ vào nồng độ khảo sát và % bắt gốc tự do thể hiện trong bảng, có thể thấy cao ethanol của A. niger thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa tốt nhất, tại nồng độ khảo sát (0,5 mg/ml) có thể bắt 88,85% gốc tự do. Tiếp theo, cao ethanol của A. subresinosum, A. exile và cao nước của A.niger lần lượt có khả năng bắt gốc tự do là 78,48%, 74,84%, 72,58%. Cao nước A. subresinosum thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa thấp nhất, tại nồng độ khảo sát 0,5mg/mL chỉ quét được 50,5% gốc tự do DPPH. Khi so sánh với cao chiết của G.lucidum, cả hai cao chiết ethanol và cao chiết nước của 04 mẫu nấm Amauroderma đều cao hơn mẫu nấm G. lucidum ở tất cả các nồng độ khảo sát.
Kalyoncu, F và cộng sự (2010) [11] đã nghiên cứu khả năng kháng oxi hóa của hệ sợi của 21 loài nấm hoang dã, trong đó có Ganoderma lucidum, loài này thuộc chi Ganoderma cùng họ Ganodermataceae với chi Amauroderma. Theo các kết quả của nghiên cứu này, cao chiết ethanol và cao nước của các loài nấm trong nghiên cứu của chúng tôi có khả năng bắt gốc tự do cao hơn rất nhiều so với kết quả nghiên cứu của F.Kalyoncu và cs (khả năng bắt gốc DPPH cao chiết nước của G.lucidum là 21,51% ở nồng độ 1mg/mL) và cao chiết methanol 45% ở nồng độ 0,5mg/mL, Mau và cộng sự (2005) [12].
Dựa vào phương pháp xác định phương trình tuyến tính phần trăm ức chế gốc DPPH ở các nồng độ khác nhau của các cao chiết, chúng tôi xác định giá trị nồng độ ức chế 50% gốc DPPH để xác định khả năng kháng oxi hóa của các mẫu nấm nghiên cứu.
Kết quả xác định giá trị IC50 về khả bắt gốc tự do DPPH của các mẫu cao chiết ethanol và cao chiết nước được thể hiện qua biểu đồ 3.1.
Từ biểu đồ cho thấy, giá trị IC50 của các cao chiết là rất khác nhau. Kết quả này tiếp tục khẳng định rằng cao ethanol của A. niger có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,20mg/mL, tiếp theo là cao ethanol A.sp yếu nhất với IC50 là 0,37mg/mL.
Cao nước của các mẫu khảo sát, khả năng bắt gốc tự do DPPH yếu hơn cao ethanol. Khi so sánh khả năng dập tắt DPPH của các cao với vitamin C, cao ethanol của 3 loài trừ A. sp có khả năng bắt DPPH cao hơn vitamin C và G.lucidum; trong khi đó cao nước của tất cả mẫu khảo sát yếu hơn vitamin C và cao hơn cao nước của G.lucidum. Kết quả này có thể phụ thuộc vào hàm lượng các nhóm hợp chất có trong cao chiết của 04 mẫu nấm Amauroderma cao hơn G.lucidum.
Từ các kết quả trên, chúng tôi sơ bộ kết luận các cao chiết của 4 mẫu nấm khảo sát đều bắt gốc tự do DPPH và cao ethanol thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH tốt hơn cao nước.
Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy, thì % khả năng bắt gốc tự do DPPH tỉ lệ thuận với nồng độ của cao phân đoạn. Điều đó chứng tỏ các phân đoạn đều chứa các chất có khả năng bắt gốc tự do DPPH. Tuy nhiên, khả năng này không giống nhau ở các phân đoạn.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH cao nhất ở phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước thấp nhất ở tất cả các nồng độ khảo sát. Từ kết quả trên cho thấy, những chất có khả năng kháng oxi hoá cao chủ yếu tập trung ở các phân đoạn ethyl acetat.
Để so sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao phân đoạn, tiếp tục xác định giá trị IC50, kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Kết quả biểu đồ cho thấy, phân đoạn ethyl acetat có giá trị IC50 nhỏ nhất (99,0181μg/mL), tiếp đến là butanol (257,8181μg/mL) nhỏ hơn giá trị IC50 của mẫu đối chứng vitamin C (268,5581μg/mL). Phân đoạn nước có giá trị IC50 cao nhất
(404,1881μg/mL). Như vậy, phân đoạn ethyl acetat (của cao ethanol) có khả năng bắt gốc tự do DPPH tốt nhất, điều này chứng tỏ, các hoạt chất tham gia vào cơ chế bắt gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ mẫu nấm A.niger có độ phân cực trung bình.
4.2.2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS cao ethanol và cao nước toàn phần
Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy, khi tăng dần nồng độ cao chiết thì khả năng bắt gốc tự do ABTS cũng tăng lên. Điều này cũng chứng tỏ các cao chiết của các mẫu nấm khảo sát đều chứa các chất kháng oxi hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do ABTS, nhưng sự thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa ở các cao chiết là khác nhau. Đối với các cao chiết ethanol, một lần nữa cao etanol A. niger lại có khả năng bắt gốc tự do ABTS cao nhất cho tất cả các nồng độ (100-500 μg/mL) ở nồng độ 500 μg/mL nó có thể bắt 92,31%, tiếp theo đến cao ethanol A. subresinosum (87,76%), cao etanol A. exile (76,74%) và thấp nhất là cao etanol A.sp (74,14%). Đối với các cao chiết nước, A. niger (62,77%) có khả năng bắt gốc tự do tốt nhất trong 4 cao chiết nước, đến cao A. exile (60,05%), cao nước A.
sp (53,30%) và thấp nhất là cao nước A. subresinosum (51,16%). Các kết quả bắt gốc tự do ABTS của các cao chiết từ 04 mẫu nấm Amauroderma đều cao hơn mẫu nấm G.lucidum ở tất cả các nồng độ khảo sát của cả cao ethanol và cao nước.So sánh với kết quả nghiên cứu của Modi và đồng nghiệp (2014) [13] cho thấy Ganoderma lucidum được thu thập tại tỉnh Dujarat (Ấn Độ) có phần trăm ức chế gốc tự do ABTS tại nồng độ 500 μg/mL là 76,32% cao hơn 4 loại cao nước và cao ethanol của A. sp, tương đương với phần trăm ức chế của cao ethanol thu từ mẫu nấm A. exile, nhưng thấp hơn cao ethanol thu được từ A. subresinosum và A. niger.
Tuy nhiên, để đánh giá thêm về khả năng bắt gốc tự do ABTS của các mẫu cao chiết thô, chúng tôi cũng tiến hành xác định giá trị IC50. Kết quả xác định giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do ABTS của các mẫu cao chiết ethanol và cao chiết nước được thể hiện qua hình 3.2.
Từ hình 3.2 cho thấy, giá trị IC50 của cao chiết ethanol ở các mẫu khác nhau là không giống nhau. Kết quả này cũng cho thấy cao ethanol của A. niger có khả năng bắt gốc tự do ABTS mạnh nhất trong 4 mẫu nấm nghiên cứu với giá trị IC50 thấp nhất (110,16μg/mL), các giá trị IC50 của ba mẫu nấm Amaurderma (trừ mẫu A.sp) cao hơn giá trị IC50 của mẫu đối chứng vitamin C (268,55 μg/mL). Cao ethanol mẫu nấm A.sp có giá trị IC50 cao nhất là 317,62 μg/mL, chứng tỏ A. sp có khả năng bắt gốc tự do ABTS thấp nhất. Trong 4 mẫu cao chiết nước của 4 mẫu nấm nghiên cứu, cao nước A. niger có khả năng bắt gốc tự do ABTS mạnh nhất với IC50 thấp nhất 384,27 μg/mL. Tuy nhiên, cả 4 mẫu cao nước của 4 loài nấm đều có IC50 cao hơn so với mẫu đối chứng vitamin C (289,00 μg/mL), chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH của chúng thấp hơn vitamin C mạnh hơn cao ethanol và nước của mẫu nấm G.lucidum.
Kết quả nghiên cứu của Anshumali Rawat và cs (2013) [6] về khảo sát hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa của Ganoderma lucidum thu thập tại vùng đồi núi Himalaya của Ấn Độ trên 2 loại cao methanol (IC50 bắt gốc DPPH 1162 ± 0016 μg/mLvà IC50 bắt gốc ABTS 555 ± 009 μg/mL) và cao nước (IC50 bắt gốc DPPH 1309 ± 012 μg/ml và IC50 bắt gốc ABTS 716 ± 006 μg/mL). So sánh kết quả của nghiên cứu này với các kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, 4 mẫu nấm nghiên cứu của chúng tôi có tiềm năng kháng oxi hoá cao hơn. Kết quả nghiên cứu của Modi và cs (2014) [14Error!
Reference source not found.] cho thấy Ganoderma lucidum được thu thập tại tỉnh Dujarat (Ấn Độ) có IC50 khả năng bắt gốc ABTS là 223,666 μg/mL thấp hơn các giá trị
IC50 khả năng bắt gốc ABTS trong nghiên cứu của chúng tôi. Từ những kết quả trên, tiềm năng kháng oxi hoá của nấm linh chi có thể phụ thuộc vào sự phân bố địa lý của chúng.
Từ bảng 3.7 cho thấy, cả 5 phân đoạn thu được đều thể hiện khả năng kháng oxi hóa tỉ lệ thuận với nồng độ cao phân đoạn. Phân đoạn thể hiện % khả năng bắt gốc tự do tốt nhất là ethyl acetat (99,00±0,811%), tiếp theo là phân đoạn butanol (85,90±0,445), phân đoạn chloroform (78,42±2,925%), phân đoạn nước (58,78±0,457%) và thấp nhất là phân đoạn hexan (52,79±0,261%).
Để so sánh khả năng bắt gốc tự do ABTS của các phân đoạn, chúng tôi xác định giá trị IC50, kết quả được thể hiện qua hình 3.4:
Qua hình 3.4 có thể thấy ethyl acetat cũng là phân đoạn có khả năng bắt gốc tự do ABTS tốt nhất với giá trị IC50 là 11,95μg/mL, tiếp theo là butanol (162,17μg/ml), chloroform (246,79μg/mL), ba phân đoạn này có khả năng bắt gốc tư do ABTS cao hơn so với mẫu đối chứng vitamin C (289,0μg/mL). Phân đoạn hexan có giá trị IC50 cao nhất, chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do ABTS là thấp nhất trong năm phân đoạn khảo sát. Qua đó cho thấy, những hợp chất có khả năng bắt gốc tự do ABTS trong cao chiết ethanol của mẫu A.niger chủ yếu thuộc nhóm chất có độ phân cực trung bình, tập trung chủ yếu ở phân đoạn ethyl acetat.
V. KẾT LUẬN
Cao chiết ethanol của 04 mẫu Amauroderma nghiên cứu đều chứa các nhóm chất thử nghiệm định tính, nhưng tập trung nhiều nhóm alkaloid, polyphenol (có cả flavonoid) và polysaccharide. Cao nước của 04 mẫu Amauroderma nghiên cứu đều chứa chủ yếu nhóm chất saponin và polysaccharid. Khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS của cao cồn cao hơn cao nước ở cả 04 mẫu Amauroderma nghiên cứu và cao hơn so với G.lucidum.
Trong đó, cao ethanol của mẫu nấm A.niger có khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS tốt nhất (IC50 lần lượt là 200 µg/mL và 110,16 µg/mL). Trong 5 cao phân đoạn của cao ethanol A.niger, nhóm hợp chất polyphenol (phenolic và flavonoid) tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethyl acetat, cũng có trong phân đoạn chloroform và n-butanol, ít hơn trong các phân đoạn còn lại khi sử dụng các phép thử định tính nhóm hợp chất. Khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS của cao phân đoạn ethylacetat là cao nhất trong 5 phân đoạn của cao ethanol A.niger với các giá trị IC50 lần lượt là 99,018 µg/mL và 11,95 µg/mL.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cooke, M.S., Evans, M.D., Dizdaroglu, M., Lunec, J., 2003. Oxidative DNA damage:
mechanisms, mutation, and disease, The FASEB Journal., 17, 1195 – 1214.
2. Chunwei, J., Yi, X., Xiangling, Y., 2013. Anticancer Activity of Amauroderma rude.
PLOS ONE., 8(6), 66504.
3. Deepshikha, G.,(2015. Method for determination of antioxidant capacty: A review.
IJPSR., 6 (2), 546-566.
4. Pooja, S, Modi, H.A.,2015. Comparative Study of DPPH, ABTS and FRAP Asaay for Determinational of Antioxidant Activity, IJRASET., 3, 2321-2323.
5. Nguyễn Thị Thu Hương,, Trương Thị Mỹ Chi., 2010. Nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa in vitro và in vivo của một số loài nấm linh chi (ganoderma lucidum) và nấm vân chi (trametes versicolor), Tạp chí y học Thành phố Hồ Chí Minh., 2(14), 1859-1779
6. Lê Xuân Thám., Nguyễn Lê Quốc Hùng., Đặng Ngọc Quang., Bùi Thị Lương., 2009.
Phân tích loài nấm Linh Chi Đen mới phát hiện được ở vườn quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai-Lâm Đồng, Tạp chí sinh học., 31(4), 55-64.
7. D.N. Quang., T.T. Nga.,L.X. Tham., 2011. Chemical Composition of Vietnamese Black Lingzhi Amauroderma subresinosum Murr, Res. J. Phytochemistry, 5, 216-221.
8. Abayomi, S.,1996. Research on medicinal plants and traditional medicine in Africa, The Journal of Alternative and Complementary Medicine., 2(3), 1996, 365-372.
9. Tiwari ,B.K., Brunton ,N.P., Charles,S. B., 2013. Handbook of Plant Food Phytochemicals: Sources, Stability and Extraction, John Wiley & Sons, Ltd.
10. Blois, M. S.,1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical.
Nature., 181, 1199-1200.
11. Kalyoncu ,F., Oskay ,M., Kayalar ,H., 2010. Antioxidant activity of the mycelium of 21 wild mushroom species. Mycology: An Internationam Journal on Fungal Biology. ,1(3), 195 – 199.
12. Mau ,J.L., Tsai ,S.Y., Tseng ,Y.H., Huang S.J., 2005. Antioxidant properties of hot water extracts from Ganoderma tsugae Murrill, LWT, 38, 589-597.
13. Modi ,H.A., Pooja, S., Shukla, M.D., Suman. K.L.,2014. Determination of total phenolic content and antioxidant activity of Ganoderma lucidum collected from Dang district of Gujarat, India, NPAIJ., 10(3), 75-83.
Ngày nhận bài: 07/8/2018- Ngày duyệt đăng: 12/9/2018)
