TI TH9A THIÊN - HU
3. K!T QU# VÀ TH#O LU%N 1
3.1 3.1
3.1. Phân lPhân lPhân lPhân l9999p np np np n####m m m m TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma t t t t@@@@ các m các m các m các mWWWWu u u u ####tttt D<a vào `c iUm hình thái, kt quG ã phân l9p E]c 50 ch(ng t@ 18 mWu #t khác nhau. Các ch(ng này E]c ký hiu t@ T1 n T50 (BGng 1).
BB
BBGng 1. Các ch(ng n#m Gng 1. Các ch(ng n#m Gng 1. Các ch(ng n#m Gng 1. Các ch(ng n#m TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma spp. phân l spp. phân l spp. phân l spp. phân l9p t@ #t9p t@ #t9p t@ #t9p t@ #t
TT Ký
hiu NguXn phân l9p
:Ma iUm l#y mWu TT
Ký
hiu NguXn phân l9p
:Ma iUm l#y mWu
1 T1 26 T26
2 T2 :#t dEFi ng rim 27 T27 :#t trXng cây lâu n=m
3 T3 28 T28
4 T4 :#t dEFi ng lá, tr#u (
QuGng
Thc 29 T29
5 T5 30 T30
6 T6 :#t dEFi gc cây
HEing
Trà 31 T31 :#t trXng lúa
Nam :ông
7 T7 32 T32
8 T8 :#t trXng lYc HEing HX 33 T33
9 T9 34 T34
10 T10 :#t dEFi ng rác 35 T35 :#t dEFi ng rác
11 T11 36 T36
12 T12 :#t trXng lúa
HEing
Long 37 T37
13 T13 38 T38
:#t dEFi ng phân chuXng (
HEing Th(y
14 T14 39 T39
15 T15 40 T40
16 T16
:#t dEFi ng phân
chuXng ( 41 T41
17 T17 :#t trXng cGi
Phong
:in 42 T42
:#t chka thân cây m"c
Phong :in
18 T18 43 T43
19 T19 44 T44 :#t dEFi gc cây
20 T20 :#t trXng lYc 45 T45
21 T21 46 T46
22 T22 :#t dEFi ng rim 47 T47
23 T23 48 T48
24 T24 49 T49
25 T25
:#t dEFi ng lá cây
m"c QuGng
Thc 50 T50 :#t trXng ngô Kim Long 3.2.
3.2.
3.2.
3.2. Sàng lSàng lSàng lccccc chSàng l c chc chc ch((((ng nng nng nng n####m m m m TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma sinh sinh sinh sinh xenlulaza v
xenlulaza vxenlulaza v
xenlulaza vFFFFi hoi hoi hoYYYYt tính mi ho t tính mt tính mYYYYnht tính m nhnh nh
Trong 50 ch(ng n#m Trichoderma E]c khGo sát có 8 ch(ng có khG n=ng sinh tbng h]p xenlulaza mYnh, hQu ht E,ng kính th(y phân trên 4 cm và td l thu9n vFi E,ng kính s]i n#m. :`c bit, hai ch(ng T25 và T26 có E,ng kính vòng phân giGi trên 7 cm (BGng 2, hình 1). Các ch(ng Trichoderma này E]c s d"ng U nghiên cku sâu hin v hoYt tính xenlulaza.
BBB
BGGGGng 2. :Eng 2. :Eng 2. :Eng 2. :E,,,,ng kính vòng phân ging kính vòng phân ging kính vòng phân ging kính vòng phân giGGGGi xenlulaza ci xenlulaza ci xenlulaza c((((a si xenlulaza c a sa s]]]]i i i i a s nnnn####m m m m TricTricTricTrichodermahodermahodermahoderma
TT Ký hiu
:K vòng phân giGi (cm)
:K s]i n#m (cm)
1 T5 4,72f 5,11g
2 T6 5,44c 6,09e
3 T10 5,15e 5,35f
4 T21 4,24g 9,51a
5 T23 4,16h 5,05h
6 T24 5,37d 6,15d
7 T25 7,82a 9,18b
8 T26 7,12b 8,97c
Ghi chú: Trong mt ct, các ch^ cái khác nhau sai khác có ý ngha vFi p<0,05. :K: :E,ng kính.
Hình 1. Vòng phân gi Hình 1. Vòng phân giHình 1. Vòng phân gi
Hình 1. Vòng phân giGGGGi xenlulaza ci xenlulaza ci xenlulaza c((((a si xenlulaza c a sa sa s]]]]i ni ni ni n####m m m m Trichoderma
TrichodermaTrichoderma Trichoderma
3333.3. .3. .3. .3. :ánh giá ho:ánh giá ho:ánh giá hoYYYYt tính c:ánh giá ho t tính ct tính ct tính c((((a xenlulaza thu nha xenlulaza thu nha xenlulaza thu nha xenlulaza thu nh9999n tn tn t@@@@ n t Trichoderma
TrichodermaTrichoderma Trichoderma
Tin hành nuôi c#y thu dMch enzym t@ 8 ch(ng E]c sàng lcc và Mnh tính khG n=ng th(y phân ci
ch#t c(a enzym này. Kt quG cho th#y xenlulaza c(a các ch(ng E]c sàng lcc có hoYt tính mYnh và có s<
khác bit gi^a các ch(ng. Trong ó, E,ng kính vòng phân giGi c(a xenlulaza t@ ch(ng T25 lFn nh#t (3,27 cm), các ch(ng khác nhE T26, T10 có E,ng kính vòng phân giGi tEing i lFn: T10 (2,67 cm) và T26 (2,57 cm). Mt s ch(ng còn lYi nhE T5, T6, T21, T24 E,ng kính vòng phân giGi nhZ hin và không E]c rõ nét (BGng 3, hình 2).
BB
BBGGGGng 3. ng 3. ng 3. ng 3. :E:E:E,,,,ng kính vòng:E ng kính vòngng kính vòng thng kính vòng th th th((((y phân y phân y phân xenlulazay phân xenlulazaxenlulazaxenlulaza c c c c((((a a a a xenlulaza
xenlulaza xenlulaza
xenlulaza tttt@@@@ các ch các ch các ch((((ng các ch ng ng ng TrichTrichodermaTrichTrichodermaoderma oderma TT Ký hiu
:K vòng th(y phân (cm)
1 T5 1,27f
2 T6 1,80e
3 T10 2,67b
4 T21 1,83e
5 T23 2,43c
6 T24 2,23d
7 T25 3,27a
8 T26 2,57b
Ghi chú: Trong mt ct, các ch^ cái khác nhau sai khác có ý ngha vFi p<0,05
Hình 2.
Hình 2.
Hình 2.
Hình 2. Vòng thVòng thVòng thVòng th((((y phân CMC cy phân CMC cy phân CMC c((((a xenlulaza ty phân CMC c a xenlulaza ta xenlulaza ta xenlulaza t@@@@
Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma
Tip t"c khGo sát hoYt tính enzym c(a các ch(ng E]c sàng lcc. Kt quG cho th#y cG 8 ch(ng Trichoderma u sGn sinh xenlulaza có hoYt mYnh, hQu ht hoYt xenlulaza trên 10 U/ml, ch(ng T10 Yt 16,81 U/ml, T26 Yt 16,64 U/ml (Hình 3). Theo kt quG nghiên cku c(a Hind
Leghlimi và cng s< (2013), khi nghiên cku khG n=ng sinh tbng h]p xenlulaza c(a T. longibrachiatum và T. reesei, hoYt xenlulaza c(a các ch(ng này là 10,42 U/ml và 10,39 U/ml. Mt nghiên cku khác c(a Gochev và Krastanove (2007) ã phân l9p E]c mt s ch(ng Trichoderma vFi hoYt xenlulaza cao:
T.atroviride (7,6 U/ml), T. longibrachiatum (11,4 U/ml), T. reesei (4,2 U/ml), T.viride (12,4 U/ml).
:i chiu vFi các kt quG nghiên cku trên, các ch(ng phân l9p E]c có hoYt xenlulaza khá cao.
:`c bit, ch(ng T25 có hoYt mYnh nh#t Yt 27,68 U/ml cQn E]c nghiên cku tip t"c U có ci s* phát triUn và s d"ng ch(ng Trichoderma này trong sGn xu#t ch phm sinh hcc kng d"ng trong th<c tin.
Khi truy xu#t nguXn gc phân l9p, ch(ng T25 E]c phân l9p tYi vùng #t chka nhiu lá cây m"c nát tXn tYi mt lE]ng lFn xenlulaza, ây là ci ch#t tt U sGn sinh enzym xenlulaza.
Hình 3. Ho Hình 3. Ho Hình 3. Ho
Hình 3. HoYYYYt t t xenlulaza ct xenlulaza c xenlulaza c((((a các ch xenlulaza c a các cha các ch((((nga các ch ngngng Trichoderma
TrichodermaTrichoderma Trichoderma
Ghi chú: Các ch^ cái khác nhau sai khác có
ý ngha vFi p<0,05 3.4.
3.4.
3.4.
3.4. :::MMMMnh danh ch:nh danh chnh danh ch((((ng nnh danh ch ng nng nng n####m m m m TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma
Các ch(ng n#m có hoYt enzym cao E]c tách chit ADN và giGi trình t<. PCR E]c th<c hin vFi ADN khuôn mWu là b gien n#m tách chit E]c. SGn phm PCR E]c in di trên gel (Hình 4). C`p mXi ITS4 và ITS5 ã khuch Yi E]c vùng ITS c(a các mWu n#m, sGn phm có kích thEFc khoGng 500-600 bp. SGn phm PCR sau ó E]c tinh chit và phân tích trình t<. Kt quG phân tích trình t< E]c thU hin trên bGng 4.
Hình 4.
Hình 4.
Hình 4.
Hình 4. :i:i:i:in di sGn phm PCR vFi c`p mXin di sGn phm PCR vFi c`p mXin di sGn phm PCR vFi c`p mXi ITS4 và n di sGn phm PCR vFi c`p mXi ITS4 và ITS4 và ITS4 và ITS5ITS5ITS5
ITS5 (M
(M (M
(M ———— 100 bp ladder marker) 100 bp ladder marker) 100 bp ladder marker) 100 bp ladder marker)
B B B
BGGGGng 4. Ging 4. Ging 4. GiGGGGi trình tng 4. Gi i trình ti trình ti trình t<<<< và tìm ki và tìm ki và tìm ki và tìm kim các chum các chum các chum các chuppppi gi gi gi gQQQQn gn gn gIi trên n gIi trên Ii trên Ii trên nnnngân hàng giengân hàng giengân hàng giengân hàng gien STT Ký
hiu
:oYn cc E]c (nucleotit)
Loài xác Mnh PhQn tr=m oYn so sánh (%)
Mkc Xng nh#t trình t< (%)
1 T5 555 Trichoderma harzianum 100 99
2 T6 555 Trichoderma harzianum 100 99
3 T10 611 Trichoderma harzianum 97 96
4 T21 555 Trichoderma harzianum 100 99
5 T23 561 Trichoderma harzianum 100 99
6 T24 555 Trichoderma harzianum 100 99
7 T25 555 Trichoderma harzianum 100 99
8 T26 527 Trichoderma
longibrachiatum 100 100
3.5.
3.5.
3.5.
3.5. VVVVnh hEnh hEnh hEnh hE****ng cng cng c((((a mng c a ma ma mt st st s yt s y y yu tu tu t u t n hon hon hon hoYYYYt tính t tính t tính t tính xenlulaza t
xenlulaza txenlulaza t
xenlulaza t@@@@ TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma harzianumharzianumharzianumharzianum T25 T25 T25 T25 3.5.1. Vnh hE*ng c(a nhit phGn kng
Khi t=ng nhit t@ 20-50oC hoYt c(a xenlulaza t=ng dQn và Yt c<c Yi tYi 50oC là 27,57 U/ml (100%) (Hình 5). Sau ó, hoYt enzym giGm xung khi nhit phGn kng t=ng, * 60oC hoYt tính
còn 20,57 U/ml, * 80oC hoYt tính enzym chd còn 9,22 U/ml.
Nh^ng nghiên cku trEFc ây cho th#y, nhit phGn kng thích h]p i vFi xenlulaza t@ Trichoderma reesei là 50oC (Nidetzky et al., 1994); hoYt xenlulaza c(a Fusarium oxysporum mYnh nh#t * 50oC (Refaz et al., 2013); xenlulaza t@ Trichoderma
longibrachiatum (GHL) mYnh nh#t * 55oC (Leghlimi, 2003); xenlulaza t@ Aspergillus niger NRRN-363 là 50oC (Hoàng Quc Khánh et al., 2003), còn hoYt endoglucanaza III t@ T. reesei Yt ti a * 55oC (Macarrón et al., 1993).
NhE v9y, nhit thích h]p cho phGn kng phân giGi ci ch#t CMC c(a xenlulaza t@ Trichoderma harzianum T25 là 50oC. Do ó, ch(ng T. harzianum T25 và xenlulaza c(a ch(ng này có thU kng d"ng trong vic x lý rác thGi và ph" phm công-nông nghip.
ch(ng Bacillus subtilis YJ1. :i vFi K+, hoYt tính tEing i cIng t=ng 119-123% khi nXng t=ng 5 - 10 mM. Còn vFi EDTA, khi nXng t=ng lên thì hoYt tính cIng t=ng nhx, * nXng 10 mM hoYt tính t=ng 101%.
4. K!T LU%N
:ã phân l9p E]c 50 ch(ng n#m Trichoderma U khGo sát khG n=ng sinh tbng h]p xenlulaza, trong ó có 8 ch(ng cho hoYt tính enzym mYnh vFi E,ng kính vòng phân giGi ci ch#t c(a s]i n#m trên 4 cm.
Các ch(ng Trichoderma harzianum T10, Trichoderma harzianum T25 và Trichoderma longibrachiatum T26 cho hoYt tính khá cao, trên 16 U/ml. :`c bit, ch(ng T25 cho hoYt xenlulaza mYnh nh#t Yt 27,68 U/ml.
HQu ht các ion kim loYi kc ch hoYt tính c(a xenlulaza t@ Trichoderma harzianum T25.
Ion kim loYi Cu2+, Mg2+, Fe2+, Na2+, Ag+ kc ch hoYt enzym còn lYi 33,07 - 48, 76% * nXng 15 mM. Ion Ba2+, Ca2+ kích thích hoYt ng c(a enzym * nXng 5 mM, * nXng 15 mM hoYt xenlulaza lYi giGm xung 67,22 — 71,34%. NXng EDTA và K+ t=ng 5 mM — 15 mM hoYt xenlulaza t=ng 120,8 — 146,9%, 101 — 122,95% i vFi ion K+. Xenlulaza t@ T.
harzianum T25 hoYt ng tt trong khoGng pH 4,5 — 5,5 nhit 50oC.
Ch(ng T. harzianum T25 và xenlulaza c(a ch(ng này có nhiu tim n=ng trong vic x lý rác thGi, ph"
phm công-nông nghip sGn xu#t thkc =n ch=n nuôi và cGi tYo #t.
LLLL¢¢¢¢I CI CI CI CVVVM £N VM £N M £N M £N
Nghiên cku này E]c tài tr] b*i Quq phát triUn khoa hcc và công ngh quc gia (NAFOSTED) trong tài mã s 106.99-2011.21.
TÀI LIU THAM KH#O
1. Adeleke A. J., Sunday A. O., Afolake O., Mojisola C. A. (2012). Production of Cellulose and Pectinase from Orange Peels by Fungi. Nature and Science, 10(5), pp. 107-112.
2. PhYm ThM Trân Châu, Phan Tu#n Ngha (2006). Công ngh sinh hcc - Enzym và kng d"ng (T9p 3). Nhà Xu#t bGn Giáo d"c, Hà Ni.
3. Elad Y., Chet I., Henis Y. (1981). A selective medium for improving qualitative isolation of Trichoderma spp. from soil. Phytoparasitica, (9), pp. 59-67.
4. Gochev V. K., Krastanove A. I. (2007).
Isolation Of Laccase Producing Trichoderma spp.
Bulgarian Journal of Agricultural Science (13), pp.
171-176.
5. Graminha E. B. N., Goncalves A. Z. L., Pirota R.
D. P. B., Balsalobre M. A. A., Da Silva R., Gomes E.
(2008). Enzyme production by solid-state fermentation:
Application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology (144), pp. 1-22.
6. TrQn ThM Thu Hà, PhYm Thanh Hòa (2012).
KhG n=ng i kháng c(a n#m Trichoderma vFi n#m bnh hYi cây trXng Sclerotium rolfsii Sacc trong iu kin invitro. TYp chí Khoa hcc-:Yi hcc Hu, 75A(6), tr. 49-55.
7. Jeffries T. W. (1996). Production and applications of Cellulose laboratory procedures handbook. US Army Materials Laboratories, pp. 1-10.
8. TrMnh :ình Khá, Quyn :ình Thi, Nguyn Sq Lê Thanh (2007). Tinh sYch si b và ánh giá tính ch#t hóa lý c(a xenlulaza t@ ch(ng Penicillium sp. DTQ-HK1.
TYp chí Công ngh Sinh hcc, 5(1), tr. 47-54.
9. Hoàng Quc Khánh, Ngô :kc Duy, Nguyn Duy Long (2003). KhG n=ng sinh tbng h]p và `c iUm xenlulaza c(a Aspergillus niger RNNL-363. Báo cáo khoa hcc, Hi nghM Công ngh Sinh hcc toàn quc. Nhà Xu#t bGn Khoa hcc và Kq thu9t, Hà Ni, tr. 304-307.
10.Leghlimi H. (2013). Production and characterization of cellulolytic activities produced by Trichoderma longibrachiatum (GHL). African Journal of Biotechnology, 12(5), pp. 465-475.
11.Liu J., Yang J. (2007). Cellulose Production by Trichoderma koningii AS3.4262 in Solid-State fermentation using ligno cellulosic waste from the vinegar industry. Food Technol. Biotechnol., 45 (4), pp. 420-425.
12.Macarrón R., Castiilón M. P., Domínguez J.
M., Manta I. D. L. (1993). Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei.
Biochemical Journal, (289), pp. 867-873.
13.Martin J. P. (1950). Use of acid, rose bengal, and streptomycin in the plate method for estimating soil fungi. Soil Science - Univ. California Citrus Experiment Station, Riverside, (69), pp. 215-32.
14.Miller G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.
AnalyticalChemistry, (31), pp. 426 - 428.
15.Nidetzky B., Stainer W., Claeyssens M.
(1994). Cellulose Hydrolysis by thhe Cellulose from Trichoderma ressei: adsorptions of two cellobiohydrolase, two endoCellulose and their core protein on filter paper and their relation to hydrolysis. Biochem. J, 303, pp. 417-413.
16.Refaz A. D., Iram S., Mohd S., Avinash B. A., Shabir A. T., Parvaiz H. Q. (2013). Isolation, purification and characterization of carboxymethyl Cellulose (CMCase) from Fusarium oxysporum endophytic producing podophyllotoxin. Advances in Enzyme Research, (1), pp. 91-96.
17.Sandhu D. K. and Kalra M. K. (1985). Effect of cultural conditions on production of Celluloses in
Trichoderma longibrachiatum. Journal Article Transactions of the British Mycological Society, 84(2), pp. 251-258.
18.Vijayaraghavan P., Vincent P. (2012). Purification and Characterization of Carboxymethyl Cellulose from Bacillus sp. Isolated from a Paddy Field. PolishJournal of Microbiology, (61), pp. 51-55.
19.White T. J., Bruns T., Lee S.,Taylor J. (1990).
Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A guide to Methods and Applications (ed.
M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky & T. J.
White), pp. 315-322. Academic Press : San Diego, U.S.A.
ISOLATION OF THE STRAIN
ISOLATION OF THE STRAIN ISOLATION OF THE STRAIN
ISOLATION OF THE STRAIN TrichodermaTrichodermaTrichodermaTrichoderma spp. PRODUCING HIGH CELLULOSE IN THUA spp. PRODUCING HIGH CELLULOSE IN THUA spp. PRODUCING HIGH CELLULOSE IN THUA spp. PRODUCING HIGH CELLULOSE IN THUA THIEN
THIEN THIEN
THIEN ---- HUE HUE HUE HUE PROVINCEPROVINCEPROVINCEPROVINCE
Phan Thi Be, Nguyen Duc Chung, Tran Thi Thu Hong, Phan Thi Be, Nguyen Duc Chung, Tran Thi Thu Hong, Phan Thi Be, Nguyen Duc Chung, Tran Thi Thu Hong, Phan Thi Be, Nguyen Duc Chung, Tran Thi Thu Hong,
Tran Thi Thu Ha, Nguyen Van Duc Tran Thi Thu Ha, Nguyen Van DucTran Thi Thu Ha, Nguyen Van Duc Tran Thi Thu Ha, Nguyen Van Duc Summary
SummarySummary Summary
Trichoderma is a well-known potential agent for resolution cellulose from industrial and agricultural by-products. Fifty Trichoderma strains were isolated from 18 soil samples in Thua Thien - Hue province. The cellulose activity of 50 Trichoderma isolates was investigated in which 8 isolates were capable producing high cellulose. After 2 day inoculation, mycelium diameter of more than 5 cm and resolution ring cellulose reached over 4 cm. Extract cellulose from 8 isolates were screening for measurement of cellulose activity in which 3 isolates were hydrolysis diameter reached over 2 cm; cellulose activity reached over 16 U/ml.
Noticeably, the isolate T25 was cellulose activity at 27.68 U/ml. The cellulose had a temperature optimum at 50oC and pH optimum at 5.0. Metal ion Cu2+, Mg2+, Fe2+, Na2+, Ag+ at concentration of 15 mM reduced 33.07
— 48.76% of cellulose activity. In contrast, K+ increased the activity from 101.93% at concentration of 5 mM to 122.95% at concentration of 15 mM. Ca2+ increased the cellulose activity at low concentration of 5 mM (119.99%). EDTA at concentration of 5-15 mM increased 120.8-146.9% of cellulose activity.
Keywords Keywords Keywords
Keywords: Cellulose activity, metal ion, soilborne fungus, Trichoderma harzianum.
NgE NgE NgE
NgE,,,,i phi phi phi phGGGGn bin bin bin bin: TS. Nguyn: TS. Nguyn: TS. Nguyn: TS. Nguyn Mn Mn Mn MYYYYnh Dnh Dnh Dnh DIngIngIngIng Ngày nh
Ngày nh Ngày nh
Ngày nh9999n bài: n bài: n bài: 13/6/2016 n bài:
Ngày thông qua ph Ngày thông qua ph Ngày thông qua ph
Ngày thông qua phGGGGn bin bin bin: n bi n: n: n: 14/7/2016 Ngà
Ngà Ngà
Ngày duyy duyy duyy duyt =ng: t =ng: t =ng: t =ng: 21/7/2016