Sàng lọc lệch bội nhiễm sắc thể g ọ ệ ộ tiền cấy phôi bằng kỹ thuật FISH

(1)

Sàng lọc lệch bội nhiễm sắc thể g ọ ệ ộ tiền cấy phôi bằng kỹ thuật FISH

và Microarray CGH và Microarray CGH

Samuel S. Chong, PhD, FACMG

Khoa nhi, Đại học Y khoa Yong Loo Lin Singapore

Trung tâm chẩn đóan phân tử, Khoa xét nghiệm Y khoa, Hệ thống trường đại học Y quốc gia

Trung tâm chẩn đoán tiền cấy phôi, Viện đại học nhi khoa, Hệ thống

ố

trường đại học Y quốc gia

(2)

Chẩn đoán Di Truyền tiền cấy phôi Chẩn đoán Di Truyền tiền cấy phôi

Chu trình

Phân tích PCR

(3)

Sinh thiết phôi

(4)

Bệnh phù nhau thai (Hemoglobin Bart’s)

(5)

Các dấu ấn Microsatellite:

16PTEL05 and 16PTEL06

Y2 Y1

16

16PTELPTEL0505 1616PTELPTEL0606

X2 Z2 X1 Z1

Y2 Y1

IZ HVR 3’ HVR

ζ2 ψζ1 μ^∗ ψα1 α2 α1 θ1

--^SEA --^MED

( )^{20 5}

IZ‐HVR 3 HVR

--^FIL

-(α)^20.5

--^THAI

(6)

Chẩn đoán PGD bệnh Hb Bart’s dựa trên kỹ thuật Microsatellite dựa trên kỹ thuật Microsatellite

M l i l Blastomere / tế bào Buffer trung hòa

Multiplex PCR

Ủ nhiệt

Buffer ly giải Combined GeneScan™

Fragment Analysis

16PTEL05 16PTEL06 QC STR

Kết quả chẩn đoán

Mẹ cha

Phát hiện đột biến dựa trên STR & kiểm chứng chất lượng

(7)

Hb Bart’s PGD – Cặp vợ chồng A

16PTEL05 16PTEL06 D7S2847

84 Vợ

117

194

179 αα/--SEA

Kiểu gen

Chồng 82

117

175 183

αα/ SEA

175 194 Phôi 1

82 84

117

αα/--SEA

Phôi 2

82 175 179

αα/αα

117 179

Phôi 3 175 194

αα/--SEA

Phôi 3

--SEA/--SEA

(8)

Hb Bart’s PGD – Cặp vợ chồng B

16PTEL05 16PTEL06 D7S2847

/ SEA Kiểu gen

125

179 187

86 Mẹ (αα/--^SEA)

αα/--SEA

125

84 Cha (αα/--^FIL) 171

αα/--FIL

117 183

αα/αα

84

86 117

125

183 187 Phôi 1 (αα/αα)

/ FIL

86 Phôi 2 (αα/--^FIL)

αα/--FIL

125

171 187

(9)

Bệnh β-Thalassemia nặng

Bệnh β Thalassemia nặng

(10)

Chẩn đoán PGD bệnh β-Thal bằng kỹ thuật minisequencing bằng kỹ thuật minisequencing

Blastomere / tế bào Buffer trung hòa

Multiplex PCR

Ủ nhiệt Buffer ly giải

Chia mẫu Minisequencing

SBE GeneScan™

Minisequencing

STR GeneScan™

Kết quả

chẩn đoán ^C ^T

+

^cha^mẹ

Phát hiện đột biến Kiểm chứng chất lượng

(11)

Chẩn đoán PGD bệnh β-Thal ằ

bằng kỹ thuật minisequencing

IVS I,5 (G→C) AS T C

-28 TATA (T→C) C

IVS II,654 (C→T)

C Cd 41/42

(ΔTTCT)

C Cd 26

(C→T) IVS I,1 (C→A) C

G C C T

Bình thường

C T G

C

T C A C

C G

Mang gen

C T

T G

C

T

C T C

A C G

T

Bệnh

G

35 50

T

25 35 20 25

A

25 35 50 62 20 25

(12)

Trường hợp chẩn đoán PGD bệnh β-Thalassemia

β/ β

IVS II,654 site -28TATA site

Chồng: β / -28TATA G→A Vợ: β / IVSII,654 C→T

β β

PGD Cycle 1 PGD Cycle 2

Chọc hút trứng 10 13

Trứng thụ tinh sau ICSI 6 5

β/ IVS II,654

Sinh thiết phôi 5 4

Số phôi chẩn đoán là:

Bình thường (β / β) 2 2

Mang gen (β/ -28) 0 1

β/ -28TATA

Mang gen (β / -28) 0 1

Mắc bệnh (IVSII,654 / -28) 1 1

Số phôi không chẩn đoán 2 0

Số phôi được chuyển 2 3

IVS II,654 / -28TATA Kiểu gen của phôi chuyển β / β

β / β

β / β β / β β / -28

Kết quả Không mang

th i

Đơn thai nam;

Sinh đủ ngày

25 35 50 62

b.thg Đột biến Đ.biến b.thg

q thai g y

(β / -28)

(13)

Sàng lọc Di Truyền tiền cấy phôi Sàng lọc Di Truyền tiền cấy phôi

Chu trình PGS

Phân tích FISH

(14)

Các chỉ định thường gặp nhất của PGS t tầ át lệ h bội hiễ ắ thể trong tầm soát lệch bội nhiễm sắc thể

M lớ t ổi

• Mẹ lớn tuổi

– Liên quan đến yếu tố nguy cơ lệch bội (Hội chứng Down, Hội chứng Turner).

– Liên quan đến trường hợp khó thụ thai và dễ q g ợp ụ sẩy thai.

– > 50% hình thái phôi bình thường của phụ > 50% hình thái phôi bình thường của phụ

nữ lớn tuổi có những bất thường về nhiễm

sắc thể.

(15)

Chiến lược PGS hiện nay –

Fluorescence In Situ Hybridization

Blastomere / Buffer ly giải / Blastomere /

Tế bào

Buffer ly giải / cố định

Hỗn hợp

21 Y

Kính hiể vi 21 Hỗn hợp

Fluorescent Probe

13

18 X

13

18

Kính hiể vi huỳnh quang

và chụp ảnh

18

Bất lợi chính: Chỉ sàng lọc được ở vị trí tâm của nhiễm sắc thể

(16)

Tương lai –

Xác định bộ nhiễm sắc thể của cả bộ gen Xác định bộ nhiễm sắc thể của cả bộ gen

Blastomere / tế bào Sản phẩm WGA DNA tham chiếu

WGA

Blastomere / tế bào Sản phẩm WGA

Thêm Green Label

DNA tham chiếu Thêm Red

Label

Array Comparative Genomic Hybridization Quét tín hiệu

huỳnh quang Phân tích

Ưu điểm chính: Sàng lọc toàn bộ nhiễm sắc thể (không chỉ ở tâm NST)

(17)

Khuếch đại toàn bộ nhiễm sắc thể

Single cells* -ve -ve Single cells* gDNA Single cells* -ve

2 00 kb 10.00 kb

1000 bp

1.00 kb 2.00 kb

2 0 b 500 bp

1000 bp

250 bp

250 bp 500 bp

Product Size: ~10.00 kb Product Size: 100 bp – 1000 bp Product Size: 250 bp – 1000 bp

Genomeplex WGA

Genomephi WGA Picoplex WGA

*47,XXY or 47,XY,+21

(18)

Array Comparative Genomic H b idi ti ( CGH)

Hybridization (aCGH)

(19)

Phân tích số lượng gen

Agilent Genomic Workbench Standard Edition 5 0 Agilent Genomic Workbench Standard Edition 5.0

(20)

Reference DNA: 46,XY

Toàn bộ gen

(Tế bào 47,XXY → WGA → 15K Oligo Array-CGH) Toàn bộ gen

(21)

Từng nhiễm sắc thể

(

Tế bào 47,XXY → WGA → 15K Oligo aCGH)

NST X

NST 4 NST 12 NST 21

(22)

Reference DNA: 46,XY

Toàn bộ gen

(Tế bào 47,XY,+21 → WGA → 15K Oligo Array-CGH)

(23)

Tại sao cần sàng lọc tất cả nhiễm sắc thể?

• Sàng lọc cả bộ nhiễm sắc thể làm tăng khả

• Sàng lọc cả bộ nhiễm sắc thể làm tăng khả năng phát hiện tất cả lệch bội của từng nhiễm sắc thể ở phôi. p

• Chỉ chuyển các phôi có bộ nhiễm sắc thể hoàn

toàn bình thường sẽ làm tăng tỉ lệ mang thai g g ệ g

sau thụ tinh ống nghiệm.

(24)

• Cảm Cảm ơn ơn