Đánh giá đa hình gen MTHFR

3.2.2.1. Phát hiện đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR bằng phương pháp realtime PCR

Để kiểm soát quá trình nhiễm chéo và đánh giá chất lượng bộ kit, mỗi lần chạy realtime PCR đều có kèm theo các chứng âm và chứng dương cho từng kiểu đa hình.

Hình 3.1: Chứng âm không có DNA

Mẫu chứng cho kết quả tốt, mẫu chứng âm không có DNA không có tín hiệu huỳnh quang chứng tỏ không có hiện tượng nhiễm chéo.

Hình 3.2. Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 677CC

Kết quả mẫu chứng kiểu gen MTHFR 677CC là một đường tín hiệu màu xanh lá cây rõ nét lên ở chu kì 22 cho thấy kết quả phân tích đạt kết quả tốt.

Hình 3.3. Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 1298AA

Kết quả mẫu chứng kiểu gen MTHFR 1298AA là một đường tín hiệu màu xanh lá cây lên ở chu kì 24 cho kết quả phân tích đạt yêu cầu.

Hình 3.4. Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 677CT

Kết quả mẫu chứng dị hợp tử gen MTHFR 677CT là hai đường tín hiệu lên ở chu kì 26 bao gồm 1đường tín hiệu màu xanh lam và 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây.

Hình 3.5. Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 1298AC

Kết quả mẫu chứng dị hợp tử gen MTHFR 1298AC là hai đường tín hiệu lên ở chu kì 24 bao gồm 1đường tín hiệu màu xanh lam và 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây.

Hình 3.6. Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 677TT

Kết quả mẫu chứng đồng hợp tử gen MTHFR vị trí 677TT là một đường tín hiệu màu xanh lam lên ở chu kì 23.

Hình 3.7. Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 1298CC

Kết quả mẫu chứng đồng hợp tử gen MTHFR vị trí 1298CC là một đường tín hiệu màu xanh lam lên ở chu kì 23.

Kết quả mẫu bệnh phẩm cho các đường tín hiệu và màu sắc tương tự các mẫu chứng: không có đa hình gen thì có 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây, kiểu dị hợp tử cho 2 đường tín hiệu và kiểu đa hình đồng hợp tử cho 1 đường màu xanh lam.

3.2.2.2. So sánh phương pháp giải trình tự gen với kết quả realtime PCR trong phát hiện đa hình gen MTHFR

Để khẳng định kết quả của kỹ thuật realtime PCR khi xác định đa hình gen MTHFR chúng tôi đã so sánh với kết quả giải trình tự gen trên máy ABI 3500. Danh sách 20 mẫu phân tích đối chứng theo phụ lục 6.

Hình 3.8. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298AA (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12

Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR 1298AA bằng phương pháp real time cho 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây, khi thực hiện bằng phương pháp giải trình tự thì vị trí 1298 lên 1 đỉnh màu xanh lá tương ứng với nucleotid A của kiểu gen AA.

Hình 3.9. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 20 Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR 1298CC bằng phương pháp real time cho 1 đường tín hiệu màu lam, khi thực hiện bằng phương pháp giải trình tự thì vị trí 1298 lên 1 đỉnh màu xanh lam tương ứng với nucleotid C của kiểu gen CC.

Hình 3.10. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 677TT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12 Kết quả real time cho 1 đường tín hiệu màu xanh lam thể hiện mẫu có kiểu gen đồng hợp tử MTHFR 677TT. Kết quả phương pháp giải trình tự cho thấy vị trí 677 lên 1 đỉnh màu đỏ tương ứng với kiểu gen đồng hợp TT.

Hình 3.11. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen

677CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 56 Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR 677CC bằng phương pháp real time cho 1 đường tín hiệu màu xanh lá cây, khi thực hiện bằng phương pháp giải trình tự thì vị trí 677 lên 1 đỉnh màu lam tương ứng với nucleotid C của kiểu gen CC.

Hình 3.12. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 1298AC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 58 Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR dị hợp tử 1298AC bằng phương pháp real time cho 2 đường tín hiệu: 1 màu xanh lá cây, 1 màu xanh lam. Khi thực hiện bằng phương pháp giải trình tự thì vị trí 1298 lên 2: 1 đỉnh màu lam tương ứng với nucleotid C và 1 đỉnh màu xanh lá tương ứng với nucleotid A của kiểu gen AC.

Hình 3.13. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen 677CT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 58 Kết quả mẫu có kiểu gen MTHFR dị hợp tử 677CT bằng phương pháp real time cho 2 đường tín hiệu: 1 màu xanh lá cây, 1 màu xanh lam. Khi thực hiện bằng phương pháp giải trình tự thì vị trí 677 lên 2: 1 đỉnh màu lam tương ứng với nucleotid C và 1 đỉnh màu đỏ tương ứng với nucleotid T của kiểu gen CT.

Việc lựa chọn ngẫu nhiên 10 mẫu nhóm bệnh và 10 mẫu nhóm chứng cho kết quả tương đồng 100% giữa giữa 2 phương pháp đã khẳng định kết quả của phương pháp realtime PCR là đáng tin cậy.