Quy trình kỹ thuật

2.5.1. Quy trình xét nghiệm Hcy, folat

- Xét nghiệm Hcy và folat đều thực hiện trên máy miễn dịch tự động Architech của Abbott theo hướng dẫn của phụ lục 5.

Hình 2.1. Mô phỏng các bước trong quy trình xét nghiệm Hcy và folat 2.5.2. Kiểm soát chất lượng và báo cáo kết quả

Kiểm soát chất lượng

- Mẫu nội kiểm được thực hiện đầu ngày theo lịch quy định gồm ba mẫu QC là Control L, Control M, Control H. Đây là những mẫu QC dạng nước, bảo quản ở 2-8^oC. Đầu ngày làm việc, hóa chất QC được lấy ra ngoài khỏi tủ lạnh phải để ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, trước khi thực hiện QC phải trộn đều.

- Kiểm soát kết quả nội kiểm bằng cách đánh giá kết quả phân tích QC hàng ngày ở các mức theo quy tắc của Westgard, đặc biệt là 8 quy tắc thường dùng 12s, 13s, R4s, 22s, 41s, 10x, hiện tượng lệch (Shift), hiện tượng trượt (Trend).

- Định kỳ thực hiện Cal lại xét nghiệm theo thời gian khuyến cáo, sau khi thay lô hóa chất mới hay sau khi bảo dưỡng máy có tác động trực tiếp đến hệ thống phân tích hoặc khi có kết quả QC không đạt.

Kết quả và báo cáo kết quả

- Theo dõi kết quả từ máy phân tích đổ ra. Kiểm tra các lỗi cảnh báo, nếu nghi ngờ kết quả cần xem xét lại máy, hóa chất và chạy lặp lại để khẳng định kết quả.

- Khoảng tham chiếu: (package insert của nhà sản xuất) Folat: + Đơn vị đo: ng/mL

+ Khoảng tham chiếu: 3.1 – 20.5 ng/mL Homocystein:

+ Đơn vị đo: μmol/L

+ Khoảng tham chiếu cho nữ: 4,44 -13,56 μmol/L 2.5.3. Phát hiện đa hình gen MTHFR

2.5.3.1. Phương pháp realtime PCR

- Mẫu máu toàn phần từ các đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA. DNA được tách từ máu bằng kít tách chiết DNA Qiagen blood mini kit.

- Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được xác định bởi máy Nanodrop, tỷ lệ OD 260/280 và 260/230 có kết quả từ 1,8 đến 2,0 là mẫu DNA đạt tiêu chuẩn.

- Sử dụng bộ kit real time PCR SNP-Express-RT của hãng Lytech (Moscow, Russia). Phân tích đa hình gen được thực hiện trên máy Biorad CF96 (USA)

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích/ phản ứng

Master Mix: Taqman probe FAM, HEX, mồi F, mồi R, dNTP, Taq polymerase

25 µL

DNA mẫu 5µL (500ng DNA)

Tổng thể tích 30 µL

Bảng 2.6. Chu kì nhiệt của phản ứng realtime PCR

Chu kì Nhiệt độ Thời gian

Biến tính 95°C 15 phút

Khuyếch đại: 25 chu kì bao gồm

Biến tính 94°C 30 giây

Gắn mồi 62°C 1 phút

Kéo dài 72°C 1 phút

Kết thúc 72°C 15 phút

Phân tích kết quả: Chu kì ngưỡng (Ct) xuất hiện trước chu kì 30 được đánh giá là đạt chất lượng.

Chất huỳnh quang HEX (xanh lá cây) được gắn với probe đặc hiệu tại C677 MTHFR hoặc A1298 MTHFR, chất huỳnh quang FAM (xanh lam) được gắn với probe đặc hiệu tại T677 MTHFR hoặc C1298 MTHFR.

- Đồng hợp tử bình thường: tín hiệu huỳnh quang màu HEX vượt đường base line trước chu kì 30, tín hiệu màu FAM không vượt ngưỡng base line.

- Dị hợp tử đa hình: Cả màu HEX và FAM đều có tín hiệu vượt đường base line trước chu kì 30.

- Đồng hợp tử đa hình: tín hiệu huỳnh quang màu FAM vượt đường base line trước chu kì 30, tín hiệu màu HEX không vượt ngưỡng base line.

2.5.3.2. Phương pháp giải trình tự

DNA được tách từ máu toàn phần bằng kít DNA Qiagen blood mini kit

theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất gồm 10 bước (phụ lục 3). Sau đó DNA trong mẫu bệnh phẩm được khuếch đại trong phản ứng PCR (Bảng 2.7 và 2.8).

Tinh sạch sản phẩm PCR, sử dụng phương pháp tủa Ethanol/EDTA. Phản ứng giải trình tự sử dụng kit BigDye^® Terminator v3.1 (Applied Biosystems Inc, ABI, Foster City, CA, USA). Giải trình tự 1 chiều. Sản phẩm sau giải trình tự tiếp tục được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol/EDTA và điện di trên

Genetic Analyzer ABI3500 (ABI). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm phân tích v5.1 DNA Sequencing của ABI và so sánh với trình tự đã được công bố trên Gene Bank.

Bảng 2.7. Trình tự mồi của phản ứng sequencing

Gen MTHFR Trình tự mồi

C677T 5’TGGGAAGAACTCAGCGAACT3’ F

5’ GGAAGGTGCAAGATCAGAGC 3’ R

A1298C 5’ ACAGGATGGGGAAGTCACAG 3’ F

5’TCTACCGTACCCAGGAGTGG 3’ R

Thành phần phản ứng bao gồm:

- Genomic DNA: 25 µl chứa 25–50 ng.

- Mồi F: 0,5 pmol.

- Mồi R: 0,5 pmol.

- Taq 2X Master Mix: 12,5 µL.

- Tổng thể tích: 37,5 µL.

Bảng 2.8. Chu kì nhiệt của sequencing

STT Chu kì Nhiệt độ Thời gian

1 Khởi đầu 95⁰C 2 phút

2 Biến tính 95⁰C 30 s

3 Gắn mồi 60°C 30 s

4 Kéo dài 72°C 1 phút

5 Kéo dài ổn định 72°C 5 phút

6 Bảo quản 4°C

Nhận định kết quả:

- Màu sắc các đỉnh tín hiệu huỳnh quang tương ứng với các loại nucleotid

như sau: Adenin (A): màu xanh lá cây, Cytoxin (C): màu xanh dương, Tymin (T): màu đỏ, G (Guanin): màu đen.

Kết quả phân tích gen MTHFR tại vị trí 677 là đồng hợp tử bình thường khi chỉ có 1 peak màu xanh dương tương ứng với CC, dị hợp tử khi 1 peak có màu xanh dương, 1 peak có màu đỏ tương ứng với CT và đa hình đồng hợp tử khi chỉ có 1 peak màu đỏ tương ứng với TT.

Kết quả gen MTHFR tại vị trí 1298 là đồng hợp tử bình thường khi chỉ có 1 peak màu xanh lá cây (AA), dị hợp tử khi có 1 peak màu xanh lá cây, 1 peak có màu xanh dương (AC) và đa hình đồng hợp tử khi chỉ có 1 peak màu xanh dương (CC).

2.6. Xử lý và phân tích số liệu