Đại cương về kháng sinh
KNO 3 K 2 HPO 4
11. Các phương pháp định lượng kháng sinh
Định lượng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy hay trong các chế phẩm được thực hiện bằng các phương pháp hoá học, hoá lý hay sinh học.
Phương pháp sinh học rất hay dùng vì tương đối chính xác lại không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
11.1. Phương pháp vi sinh vật
Định lượng kháng sinh bằng vi sinh vật dựa trên nguyên tắc kháng sinh tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật kiểm định; so sánh tác dụng với kháng sinh chuẩn đã biết sẽ tính toán được hμm lượng của kháng sinh cần phân tích. Tuy nhiên phương pháp vi sinh vật cũng có một số nhược điểm, phụ thuộc vμo nhiều yếu tố bên ngoμi nên độ chính xác cho phép ± 5%.
11.1.1. Phương pháp pha loãng liên tục
Dùng để định lượng kháng sinh trong dịch nuôi cấy hay trong dịch chiết.
Nguyên tắc: pha loãng kháng sinh trong môi trường canh thang (trong suốt) trong các ống nghiệm đã tiệt trùng thμnh các nồng độ khác nhau:
1 : 10 ; 1 : 20 ; 1 : 40 ; 1 : 80 ; 1 : 160…
hay 1 : 100 ; 1 : 200 ; 1 : 300 ; 1 : 400 1 : 800…
hay 1 : 2 ; 1 : 4 ; 1 : 8 ; 1 : 16 ; 1 : 32...
Tại mỗi nồng độ kháng sinh trong các ống nghiệm đó, cho vμo một lượng xác định vi sinh vật kiểm định. Đặt các ống nghiệm vμo tủ ấm 37°C/20 - 24 giờ đem ra đọc kết quả. Nếu ống nμo trong suốt tức lμ tại nồng độ pha loãng đó kháng sinh đã giết chết vi sinh vật kiểm định.
Ví dụ: định lượng Streptomycin trong môi trường nuôi cấy Str. griseus.
Dung dịch streptomycin chuẩn 10mcg/ml.
Tiến hμnh theo bảng sau:
Số ống nghiệm Kháng sinh
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Độ pha loãng 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:28 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 Streptomycin
chuẩn 10 μg/ml - - - - - + + + + + + +
Streptomycin thử - - - - - - - - - + + + Chú thích: dấu (-) vi khuẩn bị giết chết
dấu (+) vi khuẩn phát triển
ở ống nghiệm số 5 (độ pha loãng 1:32) của kháng sinh chuẩn vi khuẩn kiểm định không phát triển được.
Vμ ống số 10 (độ pha loãng 1:1024) của dịch kháng sinh cần định lượng vi khuẩn kiểm định không phát triển được. Có thể tính toán nồng độ kháng sinh theo công thức sau:
Xo
Dc X = Dt ì
trong đó:
Dc: độ pha loãng của kháng sinh chuẩn Dt: độ pha loãng của kháng sinh thử X: nồng độ kháng sinh cần định lượng Xo: nồng độ ban đầu của kháng sinh chuẩn trong thí nghiệm trên ta có:
ml mcg
X 10 320 /
32
1024ì =
=
Để kết quả được chính xác khi định lượng kháng sinh bằng phương pháp pha loãng cần chú ý những điểm sau:
(1) Dùng môi trường để pha loãng có thμnh phần ổn định (2) Thao tác phải tuyệt đối vô trùng
(3) Lượng vi khuẩn kiểm định cho vμo các ống nghiệm phải bằng nhau.
(4) Thời gian ủ để cho vi sinh vật kiểm định phát triển phải hằng định.
Có thể pha loãng kháng sinh cần thử vμo môi trường thạch - canh thang sau đó đổ ra hộp petri đợi thạch đông ta cấy các vi sinh vật kiểm định vμo, để tủ ấm cho vi sinh vật phát triển sau 20 - 24 giờ mang ra đọc kết quả.
Ưu điểm của phương pháp nμy lμ trên 1 hộp Petri ta có thể thử nhiều vi sinh vật kiểm định.
11.1.2. Phương pháp khuếch tán trên thạch
Nguyên tắc: kháng sinh khuếch tán vμo môi trường thạch có chứa vi sinh vật kiểm định tạo ra các vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định.
Đo độ lớn của vòng ức chế kháng sinh chuẩn vμ kháng sinh thử rồi tính toán hay tra bảng tính sẵn nồng độ sẽ cho kết quả cần phân tích.
Phương pháp khuếch tán trên thạch rất hay dùng để định lượng kháng sinh. Song để chính xác cần lưu ý đến chất lượng thạch, độ dμy lớp thạch, pH môi trường vμ nhiệt độ nuôi cấy. Những kháng sinh polypeptid rất khó khuếch tán trong thạch, nên thường cho vμo môi trường định lượng các chất lμm tăng độ khuếch tán của kháng sinh (CaCl2 lμm tăng khả năng khuếch tán của gramicidin C). Hoặc đặt các hộp petri có vi khuẩn kiểm định vμo tủ lạnh (+ 4°C) trong khoảng 5 - 6 giờ để kháng sinh kịp khuếch tán vμo trong thạch, sau đó mới đem để tủ ấm 37°C cho vi khuẩn phát triển (hình 7.2).
a b Hình 7.2. Các phương pháp định lượng kháng sinh a. Định lượng kháng sinh dùng phương
pháp khoanh giấy lọc
b. Định lượng kháng sinh dùng phương pháp đục lỗ thạch
11.2. Phương pháp hoá học vμ hoá lý
Trong thực tế một số kháng sinh được định lượng bằng phương pháp hoá học vμ hoá lý. Ưu điểm của phương pháp nμy lμ thực hiện nhanh, cho kết quả ngay. Để định lượng penicillin bằng phương pháp hoá học tiến hμnh như sau:
phá huỷ penicillin bằng kiềm, trung hoμ rồi oxy hoá các sản phẩm phân huỷ bằng iod. Định lượng iod thừa bằng Natri thiosulfat sẽ tính được iod đã tiêu thụ cho phản ứng oxy hoá vμ từ đó tính ra hμm lượng penicillin.
Nguyên tắc của phương pháp hoá lý dựa trên phản ứng tạo mμu của kháng sinh hoặc sản phẩm phân huỷ của chúng rồi đo bằng quang phổ tử ngoại hoặc máy so mμu rồi tính kết quả.
Ví dụ: để định lượng các kháng sinh nhóm tetracyclin cho tạo phức với FeCl3; đo phổ tử ngoại xác định sự biến mất các đỉnh hấp thụ cực đại của kháng sinh sau khi phân huỷ bằng kiềm.
Phương pháp so mμu định lượng erythomycin dựa trên phản ứng tạo mμu của kháng sinh với acid sulfuric (27N). Định lượng kháng sinh bằng phương pháp nμo lμ chính xác vμ thuận tiện đã được qui định rõ trong các dược điển của mỗi nước. Chỉ các kháng sinh đã được kiểm nghiệm theo các qui định ở trong dược điển mới có giá trị về pháp lý.