sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin
3. Sinh tổng hợp các Tetracyclin tự nhiên
Có gần 10 tetracyclin tự nhiên nhưng thực tế người ta chỉ sản xuất ở quy mô công nghiệp 4 sản phẩm lμ clotetracyclin, tetracyclin, oxytetracyclin vμ demeclocyclin.
3.1. Chủng giống
Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh nhóm tetracyclin tập trung chủ yếu ở xạ khuẩn. Các giống xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin gồm những chủng Streptomyces rimosus; Str.aureofaciens; Str. platensis; Str. gilvus… Cơ chế sinh tổng hợp các tetracyclin rất phức tạp với sự chuyển hoá qua nhiều giai đoạn trung gian khác nhau (cơ chế sinh tổng hợp clotetracyclin gồm 72 phản ứng). Quá trình sinh tổng hợp nμy có thể chia lμm 3 giai đoạn chính:
− Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ các nguồn hydratcarbon.
− Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thμnh bộ khung pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit).
− Chuyển hoá tiếp pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit) để tạo các tetracyclin.
OH OH OH OH
CH3
OH
CONH2
OH OH OH OH
CH3
OH
CONH2 OH
OH OH O O
CH3
OH
CONH2
O
HO
OH OH O O
CH3
OH
CONH2 HO
NH2
OH OH O O
CH3
OH
CONH2 HO
N CH3
H3C
OH O O O
CH3
OH
CONH2 HO
N CH3
H3C HO
OH O O
CH3
OH
CONH2 HO
N CH3 H3C HO
OH
(A) (B)
(D) (C)
Tetracyclin
(E) (F)
Hình 9.1. Cơ chế sinh tổng hợp tetracyclin từ pretenamid (A)
OH OH O O
CH3
OH
CONH2 HO
N CH3 H3C
OH OH O O
CH3
OH
CONH2 HO
N CH3 H3C OH
OH O OH O
OH
OH
CONH2 HO
N CH3 H3C H3C OH
(E) Pretenamid (A)
Oxytetracyclin
Hình 9.2. Cơ chế sinh tổng hợp Oxytetracyclin từ anhydrotetracycline (E)
3.2. Đặc điểm quá trình lên men
Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin lμ những chủng vi sinh vật hiếu khí nên quá trình nuôi cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí với lưu lượng khoảng 1VVM. Việc đảm bảo thông khí hợp lý vμ liên tục trong suốt quá trình lên men có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất sinh kháng sinh, đặc biệt lμ trong 6 – 12 giờ đầu tiên (quá trình có thể bị huỷ hoμn toμn nếu ngừng cấp oxy chỉ trong 5 phút). pH tối ưu cho sự phát triển lμ 6,6 – 7,2.
Mỗi bμo tử nảy 2-4 chồi tạo thμnh hệ sợi. Kháng sinh nằm trong sinh khối xạ khuẩn. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 27 – 28OC. Thời gian lên men thường khoảng 110 – 140 giờ.
3.3. Nhu cầu dinh dưỡng
Nguồn hydrat carbon chủ yếu lμ bột ngô, bột mì, tinh bột khoai tây hoặc tinh bột ngô. Ngoμi ra người ta còn bổ sung vμo môi trường nuôi cấy một số loại đường như glucose (thích hợp với S. rimosus) hoặc maltose (thích hợp với S. aureofaciens). Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin không có khả năng phân giải saccharose vμ lactose.
Nguồn nitơ: Môi trường sản xuất cần có cả nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 cũng như Nitơ hữu cơ (cao ngô, bột đậu tương, bột lạc...).
Nguồn phospho: Đối với quá trình sinh tổng hợp các tetracyclin hμm lượng phospho vô cơ hoμ tan trong môi trường lên men (chủ yếu từ cao ngô) có ý nghĩa rất quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh: thiếu phospho giống phát triển kém vμ hiệu suất lên men thấp, thừa phospho giống phát triển nhanh nhưng hoạt lực kháng sinh giảm đáng kể do sự tích tụ acid acetic vμ acid pyruvic trong môi trường. Để tránh thừa phospho người ta bổ sung CaCO3 để tạo thμnh các phosphat calci không tan. Ngoμi ra nó còn có tác dụng giảm nồng độ các kháng sinh hoμ tan để tránh độc tính của kháng sinh đối với giống.
Nguồn kim loại vi lượng: Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin cũng cần một số kim loại như Mg, Mn, Fe, Cu… vμ thường được bổ sung dưới dạng muối sulfat. Nếu môi trường có cao ngô, bột đậu, bột lạc… thì không cần bổ sung vì bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối kim loại. Cần chú ý đặc biệt đến hμm lượng sắt vì nếu sắt thừa sẽ kết hợp với Tetracyclin tạo ra những phức chất không có hoạt tính kháng sinh.
ở pha phát triển thứ nhất trong điều kiện lên men chìm, các chủng xạ khuẩn nμy sinh trưởng mạnh trong khoảng từ 24 – 48 giờ vμ khối lượng khuẩn ty đã đạt tới 70 – 80% mức tối đa, lượng chất dinh dưỡng tiêu thụ từ 60 – 80%.
Bước sang pha lên men thứ hai quá trình phát triển chậm lại nên tốc độ tiêu thụ chất dinh dưỡng giảm đi rất nhiều, sự tăng sinh khối (lượng khuẩn ty) chậm lại dần đạt tới mức độ cực đại rồi ổn định vμ xạ khuẩn bước sang giai đoạn tự phân. Trong giai đoạn nμy lượng chất dinh dưỡng trong môi trường còn lại rất ít vμ hầu như không được sử dụng.
Sự tổng hợp kháng sinh: Nghiên cứu động thái của quá trình lên men cho thấy các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin bắt đầu pha thứ hai ở khoảng thời gian 25 - 35 giờ; sinh khối đạt mức cao nhất ở 45 - 50 giờ (đối
với Str. aureofaciens) vμ ở 48 - 55 giờ (đối với Str. rimosus lμ chủng phát triển chậm hơn). Lượng kháng sinh đạt tối đa ở 120 -144 giờ. Hiệu suất sinh tổng hợp lên tới 20.000 mcg/ml môi trường lên men với những chủng siêu tổng hợp.
3.4. Nguyên tắc chiết xuất kháng sinh từ môi trường lên men
Các kháng sinh nhóm tetracyclin có tính chất lưỡng tính nên có thể dùng cả 3 phương pháp sau để chiết tách sản phẩm ra khỏi dịch lên men:
ư Chiết bằng dung môi hữu cơ có chất mang ư Chiết bằng phương pháp kết tủa
ư Chiết bằng phương pháp trao đổi ion
Tuỳ theo loại kháng sinh cụ thể, độ tinh khiết cần thiết của sản phẩm mμ người ta lựa chọn phương pháp thích hợp. Dưới đây mô tả quy trình sinh tổng hợp vμ chiết xuất một số kháng sinh cụ thể của nhóm tetracyclin.