Sinh tổng hợp Streptomycin

2.1. Đại cương

Streptomycin đặc biệt có tác dụng trên trực khuẩn lao (Mycobacterium tubeculosis) vμ được phát hiện lần đầu tiên vμo tháng 4 năm 1944 do Waksman S. A vμ cộng sự chiết được từ môi trường nuôi cấy Streptomyces griseus. Đây lμ một mốc quan trọng trong lịch sử y học vì đó lμ chất kháng sinh đầu tiên có khả năng khống chế được bệnh lao.

Mặc dù có nhược điểm lμ độc tính cao trên cơ quan thính giác nếu dùng lâu, song streptomycin vẫn lμ kháng sinh được sử dụng để điều trị lao kết hợp với một số thuốc khác có hiệu quả. Hiện nay ở các nước phát triển streptomycin đã được thay thế bằng

một số kháng sinh bán tổng hợp khác vì một mặt streptomycin gây tổn thương cho cơ quan thính giác, mặt khác ngμy cμng có nhiều vi khuẩn có khả năng kháng lại streptomycin. Một số chủng xạ khuẩn được sử dụng để sinh tổng hợp streptomycin lμ: Str. reticuli, Str. bikiniensis, Str. raneus, Str. humidus,

Hình 10.2. Nhà bác học Selman Abraham Waksman (1888 – 1973)

Str. griseocarneus. Tuy nhiên trong công nghiệp chủ yếu người ta sử dụng một số biến chủng Str. griseus có khả năng kháng actinophage cao.

2.2. Cấu trúc hoá học vμ tính chất

Công thức hoá học của streptomycin được xác định từ những năm 1946 – 1948. Phân tử streptomycin bao gồm 3 phần chính được liên kết với nhau bằng dây nối glycosid:

1- Streptidin là dẫn chất diguanidin của meso - inosid 2- Streptose là loại đường L có chứa nhóm aldehyd ở C₃

3- Metyl glucosamin là đường loại L có chứa nhóm metylamin ở C₂.

Hai phần sau liên kết với nhau bằng dây nối glycosid tạo ra phân tử gồm hai loại đường được gọi là streptobiosamin.

Streptomycin chỉ có hoạt tính khi phân tử còn nguyên vẹn. Nếu cắt bỏ phần nμo trong phân tử đều lμm kháng sinh mất tác dụng. Tuy nhiên nếu khử nhóm aldehyd (bằng H₂/Pd) thμnh nhóm alcol tạo ra dihydrostreptomycin lại có tác dụng mạnh trên trực khuẩn lao nên dihydrostreptomycin được sử dụng điều trị lao. Tuy nhiên sau nμy người ta nhận thấy dihydrostreptomycin tuy ít độc hơn streptomycin nhưng lại dễ gây điếc hơn nên hiện nay không sử dụng nữa.

Streptomycin lμ bột trắng, không mùi, vị đắng, hút ẩm mạnh. Dễ tan trong nước do có nhiều nhóm hydroxyl vμ amin, ít tan trong etanol, không tan trong ete vμ cloroform. Được sử dụng nhiều hơn cả lμ dạng muối sulfat. Dạng muối nμy bền trong không khí vμ ánh sáng.

Streptomycin không hấp thu qua đường ruột nên dùng để tiêm bắp. Có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp protein của vi

(2)

(3) (1)

khuẩn. Phổ kháng khuẩn của streptomycin gồm các vi khuẩn Gram (-) hiếu khí vμ một số vi khuẩn Gram (+), streptomycin không có tác dụng trên các vi khuẩn kỵ khí.

2.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp

2.3.1. Chủng giống

Trong sản xuất công nghiệp người ta sử dụng các biến chủng của Streptomyces griseus như ATCC11429.

Xạ khuẩn S. griseus lμ vi sinh vật hiếu khí mạnh nên quá trình nuôi cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 26 – 28^OC. pH tối ưu cho sự phát triển lμ 6,8 – 7,2. Thời gian lên men khoảng 96 – 120 giờ – 144 giờ.

2.3.2. Điều kiện lên men

Nguồn carbon: Nguồn hydratcarbon Str. griseus đồng hoá được lμ tinh bột, dextrin, maltose, fructose… Chủ yếu sử dụng tinh bột vμ glucose vì cả 3 thμnh phần cấu tạo của Streptomycin đều có nguồn gốc từ glucose. Tuy nhiên ngoμi streptomycin trong môi trường lên men còn tạo thμnh manosidostreptomycin (hay còn gọi lμ streptomycin B) có hoạt tính kháng sinh yếu. Khi môi trường chứa quá nhiều glucose thì sẽ tạo thμnh một hỗn hợp không mong muốn của cả 2 loại streptomycin. Nguồn carbon vừa giúp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, đồng thời tham gia trực tiếp vμo phân tử kháng sinh streptomycin.

Nguồn nitơ: Nguồn nitơ vô cơ thích hợp lμ các muối amoni vμ không thích hợp với các muối nitrat.

Str. griseus còn có khả năng sinh trưởng vμ tạo kháng sinh streptomycin trên môi trường chứa protein như bột đậu tương, bột cá, men khô, gluten bột mì vì loμi xạ khuẩn nμy có hệ protease mạnh nên có khả năng phân huỷ các protein thμnh các acid amin vμ sử dụng các acid amin nμy trong quá trình trao đổi chất.

Nguồn phospho: Cần phospho vô cơ hoμ tan có trong KH₂PO₄ để cho giống sinh trưởng vμ phát triển bình thường. Thiếu phospho hoμ tan thì sinh trưởng của khuẩn ty yếu do sự đồng hoá carbon vμ nitơ bị chậm vμ hoạt lực kháng sinh thấp. Tuy nhiên thừa phospho sẽ tăng nhanh tốc độ sử dụng hydratcarbon lμm cho quá trình tạo bμo tử rút ngắn, do đó ức chế sự tổng hợp streptomycin.

NaCl: Thực nghiệm cho thấy thêm NaCl vμo môi trường lên men thì hiệu suất sinh tổng hợp streptomycin tăng. Có lẽ NaCl có tác dụng lμm thay đổi tính thấm của thμnh tế bμo nên kháng sinh tiết vμo môi trường dễ dμng hơn vμ không gây ức chế lên chủng sinh streptomycin.

CaCO₃: Trong môi trường nuôi cấy cần có CaCO₃ với mục đích lμm ổn định pH.

Nguồn kim loại vi lượng: Chủng xạ khuẩn sinh streptomycin cũng cần một số kim loại như Mg, Mn, Fe, Cu… vμ thường được bổ sung dưới dạng muối sulfat. Nếu môi trường có cao ngô, bột đậu, bột lạc… thì không cần bổ sung vì bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối kim loại.

Quá trình lên men kéo dμi khoảng 120 - 144 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 - 28^OC, pH môi trường 6,8 - 7,2. Cấp khí với lưu lượng 1 VVM. ở pha phát triển thứ nhất, chủng xạ khuẩn nμy sinh trưởng mạnh sau 6 - 8 giờ. Các bμo tử nảy chồi, mỗi bμo tử nảy 1 chồi tạo thμnh hệ sợi. Khuẩn ty thẳng vμ phân nhánh yếu, tế bμo chất ưa kiềm. Bước sang pha lên men thứ hai quá trình phát triển chậm lại hệ sợi không phát triển nữa mμ bước vμo giai đoạn tự phân ở ngμy thứ 3 (khoảng 72 giờ). Chủng Str. griseus rất nhạy cảm với phage, do đó quá trình lên men cần giữ vô khuẩn rất chặt chẽ vμ cần kiểm tra độ vô trùng 4 giờ/lần.

Trong điều kiện tối ưu hiệu suất sinh tổng hợp tạo streptomycin của xạ khuẩn Str. griseus đạt tới 20.000 – 25.000 đv/ml môi trường.

Các môi trường sinh tổng hợp có thμnh phần như sau:

Môi trường giữ giống (%)

Glucose 2,0

Pepton 0,5

Cao thịt 0,5

NaCl 0,5

Agar – agar 2,0

pH 6,8 – 7,2

Khử trùng 115^OC trong 20 phút.

Nhiệt độ nuôi cấy 28^OC Thời gian nuôi cấy 5 –7 ngμy.

Môi trường nhân giống (%) Glucose 4,0

Bột đậu 3,0 (NH₄)₂SO₄ 0,6

NaCl 0,3

CaCO₃ 0,6

KH₂PO₄ 0,01

Dầu phá bọt 0,5 pH 6,8 – 7,2

Khử trùng bằng hơi nóng ở 120^OC trong 60 phút. Khi môi trường hạ nhiệt độ xuống 28 - 30^OC thì cấy giống vμo với tỷ lệ 0,5 lít/600 lít môi trường.

Giống được nuôi trong vòng 40 – 48 giờ ở nhiệt độ 28^OC. Cấp khí vô trùng với lưu lượng 1 VVM. Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt tự động bằng dầu lạc đã khử trùng.

Giống được truyền sang nồi nhân giống cấp 2 vμ được nuôi dưỡng trong điều kiện như trên trong thời gian 36 – 40 giờ.

Môi trường lên men tạo streptomycin (%) Glucose 4,0

Bột đậu 3,0 (NH₄)₂SO₄ 0,6

NaCl 0,25

CaCO₃ 0,6

KH₂PO₄ 0,01