1.4. Chiết xuất polymyxin từ môi trường lên men
Trong công nghiệp để chiết polymyxin đã sử dụng phương pháp trao đổi ion. Bản chất hoá học của kháng sinh lμ polypeptid. Các acid amin trong phân tử polymyxin có chứa các nhóm amin tự do, có khả năng trao đổi với nhóm carboxyl của phân tử nhựa loại carboxycationit. Như KB-2, KB-HP-2, Amberlit, IRC-50 ... Quá trình chiết có thể tiến hμnh như sau:
Dịch lên men xong được acid hoá đến pH 3,5 ữ 4,0 để giải phóng kháng sinh (có thể sử dụng acid oxalic để loại ion calci). Lọc loại sinh khối. Dịch lọc trung hoμ bằng NaOH. Có thể chiết polymyxin từ dịch lọc nμy bằng dung môi hữu cơ n-butanol. Sau đó kết tủa bằng aceton.
Dịch lọc đã trung hoμ được lọc qua bông thuỷ tinh đến trong suốt rồi bơm qua các cột trao đổi ion dạng Na+(R-COO-Na+). Cột đã bão hoμ kháng sinh rửa bằng nước cất hay nước đã khử khoáng.
Phản hấp phụ kháng sinh bằng acid hydrocloric hay sulfuric 10%. Dịch phản hấp phụ tẩy mμu bằng than hoạt, lọc loại than. Dịch lọc đem loại các cation kim loại bằng sulfocationit ví dụ: KU-2-20 hay SBS - 1. Trung hoμ dịch bằng cách cho chảy qua cột anionit dạng OH–.
Dịch kháng sinh đã trung hoμ được bốc hơi trong chân không ở nhiệt độ
≤ 35°C, áp suất 10 – 15 mmHg. Sau đó phun sấy để thu lấy kháng sinh.
Hình 13.2. Cấu trúc hóa học của phân tử bacitracin A
Chế phẩm bacitracin chứa chủ yếu bacitracin A lμ bột trắng xám, vị đắng gắt, tan trong nước vμ ethanol. Không tan trong ether, chloroform, aceton.
Bền trong dung dịch acid, không bền trong dung dịch kiềm. Hoạt tính kháng sinh thấp dần từ bacitracin A đến bacitracin F.
Bảng 13.1. Hoạt tính kháng sinh của các bacitracin Bacitracin Hoạt lực tương tương đối của bacitracin trên
Corynebacterium xerosis
A 1
B 0,075
C 0,500
D 0,014
E 0,008
F1 0,055
F2 0,028
F3 0,014
G 0,140
Bacitracin có tác dụng kìm khuẩn hay diệt khuẩn nhờ khả năng ức chế tổng hợp vỏ tế bμo của vi khuẩn. Nó có hoạt tính cao đối với các vi khuẩn Gram (+) hoạt phổ giống với penicillin, ít tác dụng trên vi khuẩn Gram (-).
Trước đây bacitracin được dùng để tiêm nhưng do độc tính cao trên thận nên hiện nay chỉ dùng tại chỗ để điều trị các vết thương ngoμi da, một số bệnh về mắt. Thường được sử dụng dưới dạng phức hợp bacitracin kẽm hay dưới dạng hỗn hợp với neomycin hoặc polymyxin B.
Trong nông nghiệp, phức hợp bacitracin kẽm được dùng để lμm chất kích thích tăng trưởng.
2.3. Điều kiện lên men
2.3.1. Chủng giống
B. licheniformis lμ những trực khuẩn có bμo tử, sống hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp lμ 37OC. Trong công nghiệp để sản xuất bacitracin đã sử dụng các chủng có số hiệu ATCC 9945, 10716, 11945, 11946 vμ 14580.
2.3.2. Môi trường dinh dưỡng
Tỷ lệ giữa hydrat carbon vμ nitơ rất quan trọng trong thμnh phần môi trường nuôi cấy B. licheniformis để sinh tổng bợp bacitracin. Nếu tỉ lệ nμy thích hợp sẽ tạo ra bacitracin vμ nếu tỉ lệ trên không thích hợp sẽ tạo ra licheniformin có hoạt tính kháng khuẩn rất thấp.
Môi trường thạch nghiêng giữ giống (w/v):
Trypton 5,0
D-glucose 1,0
Dịch chiết nấm men 2,5
Agar 15,0
Môi trường nhân giống (w/v):
Pepton 10,0
Glucose 5,0
Cao thịt 5,0
NaCl 2,5
MnCl2 0,167
pH 7,0
Môi trường lên men (w/v):
Citric acid 1,0
Glucose 0,5
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0,5
MgSO4. 7H2O 0,2 MnSO4. 4H2O 0,01
Hình 13.2. Trực khuẩn B. licheniformis sinh bacitracin
FeSO4. 7H2O 0,01 Dầu phá bọt theo nhu cầu
pH 7,0
Tiến hμnh lên men ở 37OC. B. licheniformis lμ chủng hiếu khí nên cần cấp khí mạnh với lưu lượng 1VVM (nhất lμ trong 6 giờ đầu). Máy khuấy tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt bằng dầu cọ hoặc dầu lạc. Thời gian lên men khoảng 45-50 giờ.
Bacitracin có thể được chiết xuất bằng dung môi hữu cơ (n-butanol hay ethanol) theo quy trình sau: Dịch lên men được ly tâm để loại nước, acid hoá sinh khối để chiết kháng sinh ra khỏi tế bμo vi khuẩn. Lọc loại tế bμo. Dịch lọc đem chiết kháng sinh bằng ethanol hoặc n-butanol. Cô kết tinh lấy tinh thể bacitracin.
Dạng muối kẽm của bacitracin bền vững hơn nên người ta có thể tạo muối ngay từ khi chiết kháng sinh khỏi môi trường lên men. Phương pháp nμy hay áp dụng để lấy sản phẩm dùng trong chăn nuôi. Kết thúc lên men thêm dung dịch ZnSO4 0,01% để tạo phức kẽm – bacitracin bền vững. Dịch thu được được cô chân không ở nhiệt độ ≤ 40OC đến hμm lượng chất đặc lμ 40%, sau đó phun sấy sẽ thu được bột bacitracin thô dùng trong chăn nuôi. Bảo quản ở chỗ khô mát, nhiệt độ ≤ 25OC.
bacitracin pH = 2,5 - 3,0 ly tâm
acid hóa
dịch lên men
Chiết ethanol
kết tinh cô sinh khối
Sản phẩm thô cho chăn nuôi
sấy phun cô tạo phức
(a) (b)
ZnSO4
< 40oC
hàm lượng chất đặc còn 40%
Hình 13.3. Quy trình chiết xuất bacitracin trong y học (a) và trong chăn nuôi (b)
Tù lưîng gi¸
1. T×m mèi liªn hÖ chung vÒ cÊu tróc gi÷a polymycin vμ bacitracin.
2. Nªu tªn chñng vi sinh vËt sinh tæng hîp polymycin vμ ®iÒu kiÖn lªn men t¹o kh¸ng sinh.
3. Tr×nh bμy quy tr×nh lªn men vμ chiÕt xuÊt bacitracin.