sản xuất Các kháng sinh nhóm β -lactam
CH 3 COOH
4. Sản xuất các Cephalosporin
bμo E.coli hay B. megatherium để sản xuất 6-APA hiệu quả cao như dùng phương pháp enzym bất động. Phương pháp nμy có thể sử dụng nhiều lần vμ dịch penicillin G chưa bị deacetyl hoá có thể sử dụng lại. 6-APA được tách ra vμ tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion, sấy phun sương hoặc kết tủa ở điểm đẳng điện (pH = 4,3).
Phương pháp enzym bất động để sản xuất 6-APA cho hiệu suất tương đối cao (90 – 95%) vμ đã được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hơn 50% sản lượng 6-APA trên toμn thế giới được sản xuất theo phương pháp bất động enzym. Hiện nay một số nhμ máy lên men penicillin chỉ cho xuất xưởng thμnh phẩm lμ 6-APA.
Để tạo ra các penicillin bán tổng hợp có thể sử dụng cả phương pháp hoá học vμ sinh học bằng cách acyl hoá 6-APA. Tuy nhiên ở công đoạn nμy người ta sử dụng phổ biến con đường hoá học như đã đề cập ở trên vì enzym acylase thường thể hiện đồng thời cả 2 hoạt tính synthetase vμ hydrolase, thay đổi tuỳ theo điều kiện phản ứng nên cho hiệu suất thấp.
Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau (xem bảng 8.4) nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin lμ có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các cầu khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) vμ độc tính rất thấp. Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu.
Bảng 8.4. Một vài cephalosporin và cephamycin tự nhiên
Tên kháng sinh R1 R2 R3
Cephalosporin C
H O O C
CH (CH2)3
H2N - H - OCOCH3
Cephamycin A H O O C
CH (CH2)3
H2N - OCH3 OCOC CH OH
OCH3
Cephamycin B H O O C
CH (CH2)3
H2N - OCH3 OCOC CH OH
OCH3
OH Cephamycin C
H O O C
CH (CH2)3
H2N - OCH3 OCOC CH OS O3H
OCH3
Oganomycin G
H O O C
CH (CH2)3 H2N
- OCH3 N
N N S N
CH3
Oganomycin H
H O O C
CH (CH2)3 H2N
- OCH3
N N
S S CH3
4.2. Cấu trúc hoá học vμ phân loại
Bảng 8.5. Phân loại các thế hệ cephalosporin
Tên nhóm Tên kháng sinh Phổ tác dụng
- Các Cephalosporin thế hệ 1
Cephalexin Cephalothin Cefazolin Cephradin
Streptoccoci, Staphylococcus aureus
- Các Cephalosporin thế hệ 2
Cefuroxim Cefaclor Cefamandol
Các Cephamycin (được xếp cùng với cephalosporin thế hệ 2)
Cefoxitin Cefmetazol Latamocef
E.coli, Klebsiella, Proteus
H.influenzae, Moraxella catarrhalis không có tác dụng lên các vi khuẩn Gram (+) Bacteroides Pragilis và các Bacteroides khác
- Các Cephalosporin thế hệ 3
Cefotaxim Ceftriaxon Ceftazidim Cefoperazon Moxalactam
E.coli, Klebsiella, Proteus
H.influenzae, Moraxella catarrhalis, ít tác dụng lên các vi khuẩn Gram (+) Bacteroides pragilis và các Bacteroides khác
- Các Cephalosporin thế hệ 4
Cefepine Cefpirome Cefaclidine
Giống như thế hệ 3 nhưng có hoạt tính mạnh hơn chống lại các vi khuẩn tiết betalactamase
Các cephalosporin vμ cephamycin có cấu trúc gồm vòng β-lactam liên kết với dị vòng dihydrothiazin (nhân cephem). Các cephamycin khác với các cephalosporin ở nhóm –OCH3 tại vị trí C7 (R2).
Những cephalosporin có tác dụng điều trị trong y học đều lμ các cephalosporin bán tổng hợp. Chúng được phân loại thμnh các thế hệ không chặt chẽ tuỳ theo phổ tác dụng vμ thời gian công bố thuốc. Hiện nay có 4 thế hệ kháng sinh cephalosporin (bảng 8.5).
Tuy cephalosporin C không có ý nghĩa trong điều trị nhưng nó lại lμ nguồn nguyên liệu để tạo ra 7-ACA vμ 7-ADCA lμ những nguyên liệu trung gian quan trọng để tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp sẽ được đề cập đến trong phần sau.
4.3. Quy trình sinh tổng hợp cephalosporin C
Để sản xuất Cephalosporin C người ta thường sử dụng các chủng giống Cephalosporium acremonium có hoạt lực cao. Tuy nhiên việc hoμn thiện vμ triển khai sản xuất công nghiệp cephalosporin C gặp nhiều khó khăn hơn so với sản xuất penicillin vì hoạt tính sinh kháng sinh của chủng gốc thường rất thấp vμ việc tuyển chọn, cải tạo hoạt tính của chủng chưa tạo ra chủng có năng lực siêu tổng hợp như chủng sinh penicillin. Mặt khác các chủng lên men cephalosporin dường như không có hoạt tính enzym acyltransferase nên việc sử dụng tiền chất tạo nhánh nhằm thay đổi hoạt tính của sản phẩm tạo thμnh trong quá trình lên men cephalosporin không mang lại kết quả đáng kể.
Hình 8.3. Hình thái chủng nấm mốc C. acremonium
Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng các chủng giống Cephalosporium acremonium ATCC 48272, 11550, 20339 vμ biến chủng của chúng. Hoạt lực khoảng 2000 mcg/ml môi trường nuôi cấy.
Trong môi trường lên men, chủng C. acremonium sinh tổng hợp đồng thời cephalosporin C, cephalosporin P1 vμ penicillin N. Trong quá trình sinh tổng hợp cephalosporin các acid amin L-alpha-aminoadipic acid, L-valin vμ L-cystein cũng đóng vai trò như các tiền chất tạo thμnh cấu trúc penicillin N (xem chuyên luận penicillin) để từ đó hình thμnh nên phân tử cephalosporin C theo con đường trình bμy trong hình 8.4.
Môi trường nuôi cấy để sinh tổng hợp Cephalosporin có thμnh phần như sau (w/v):
Saacharose 36,0 g Glucose 27,0 g (NH4)2 SO4 7,5 g Oleic acid 1,5 g
Các yếu tố vi lượng (K, Fe, Mn, Mg, Zn, Cu…) Nước máy vđ 1 lít
pH 7,3
Về nguyên lý, quy trình lên men cephalosporin C có nhiều điểm tương đồng với công nghệ lên men sinh tổng hợp penicillin về thμnh phần môi trường nuôi cấy, thông khí… cũng như các thông số khác.
N
S CH3
CH3
O COOH
CONH (CH2)3 H2NCH
HOOC
N O CONH (CH2)3
H2NCH HOOC
S
CH3
COOH
N O CONH (CH2)3
H2NCH HOOC
S
CH3
COOH
N O CONH (CH2)3
H2NCH HOOC
S
CH2OH COOH
N O CONH (CH2)3
H2NCH HOOC
S
CH2OH COOH
N O CONH (CH2)3
H2NCH HOOC
S
CH2
COOH
OCOCH3
Acetyl-CoA O2 + - 2 H
Penicillin N
Cephalosporin C
Hình 8.4. Cơ chế sinh tổng hợp cephalosporin C (giai đoạn cuối từ penicillin N)
5. Sản xuất 7–ACA; 7–ADCA vμ các kháng sinh bán tổng hợp