Sinh tổng hợp Gentamicin

3.1. Đại cương

Gentamicin được phát hiện lần đầu vμo năm 1963 trong môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn Micromonospora purpurea. Cùng với tobramycin (1975) vμ amikacin (1976), gentamicin có thể được coi như kháng sinh thế hệ 2 của nhóm aminoglycosid. Gentamicin được sử dụng rộng rãi nhất trong số các aminoglycosid vì có phổ kháng khuẩn rộng vμ đặc biệt có tác dụng trên các vi khuẩn Gram (-).

3.2. Cấu trúc hoá học vμ tính chất

Gentamicin sulfat lμ một phức hợp sulfat của 3 chất chủ yếu có cấu trúc gần giống nhau được gọi lμ gentamicin C₁, gentamicin C_1a vμ gentamicin C₂,

ngoμi ra còn một phần rất nhỏ gentamicin C_2a vμ gentamicin C_2b. Các chất nμy đều lμ dẫn chất của DOS (2-deoxystreptamin).

Gentamicin có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (+) vμ Gram (-). Phổ diệt khuẩn chủ yếu trên các vi khuẩn hiếu khí Gram (-) vμ các tụ cầu khuẩn, kể cả các chủng tạo ra penicillinase vμ kháng methicillin.

Gentamicin không hấp thu qua đường tiêu hoá, được sử dụng dạng tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp (thường bμo chế dạng dung dịch tiêm chứa 2;

10 mg/ml vμ 40; 80; 160 mg/2 ml). Gentamicin thường được dùng phối hợp với các kháng sinh khác (β-lactam) hoặc cùng với các chất diệt khuẩn khác để mở rộng phổ tác dụng vμ tăng hiệu lực

Bảng 10.3. Cấu trúc hoá học của gentamicin theo Dược điển Anh BP 2003 Tên

gentamicin

Thành phần

%

Công thức cấu tạo

R₁ R₂ R₃

C₁ 20 - 35 C₂₁H₄₃N₅O₇ CH₃ NH₂CH₃ H

C_1a 10 - 30 C₁₉H₃₉N₅O₇ H NH₂ H

C₂ C₂₀H₄₁N₅O₇ CH₃ NH₂ H

C_2a C₂₀H₄₁N₅O₇ H NH₂ CH₃

C_2b

40 - 60

C₂₀H₄₁N₅O₇ CH₃ NH₂ H 3.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp

3.3.1. Chủng giống

Gentamicin do một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Micromonospora tạo ra.

Trong thực tế chủng M. purpurea var. nigrecens vμ M. echinospora lμ những chủng quan trọng nhất được ứng dụng vμo sản xuất công nghiệp.

M. purpurea var. nigrecens lμ chủng vi sinh vật hiếu khí, không hoặc rất ít tạo bμo tử, do đó giống cần giữ trong điều kiện lạnh sâu tới -20 đến -30^OC.

Micromonospora hầu như chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không hình thμnh khuẩn ty khí sinh. Đường kính khuẩn ty từ 0,4 – 0,8mcm. Khi chưa tạo bμo tử bề mặt khuẩn lạc có mμu vμng sáng đến mμu da cam hoặc nâu đỏ tuỳ thuộc vμo môi trường vμ điều kiện nuôi cấy.

3.3.2. Quy trình lên men Môi trường giữ giống (%):

Pepton 0,6

Cao nấm men 0,3

Cao thịt 0,15

Casein thuỷ phân 0,4

Glucose 1,0

(NH₄)₂SO₄ 0,35 KH₂PO₄ 0,1 MgSO₄.7H₂O 0,5

Thạch 2%

Nước máy vđ

pH 6,8 – 7,0

Nhiệt độ nuôi cấy 28^OC Môi trường nhân giống (%):

Tinh bột khoai tây 1,0 Bột đậu tương 1,0 Saccharose 1,0

CaCO₃ 0,4

CoCl₂.6H₂O 0,002

Nước máy vđ

pH 6,8 – 7,0

Nhiệt độ nuôi cấy 28^OC Nhiệt độ nuôi cấy 28^OC

Môi trường lên men (%):

Bột ngô 2,5 Bột đậu tương 3,0 Saccharose 1,0

CaCO₃ 0,4

Alpha amylase 0,001 CoCl₂.6H₂O 0,002 Dầu phá bọt 0,6

Nước máy vđ

pH 6,5 – 6,7

Lên men tạo gentamicin được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm.

Quá trình nμy được thực hiện theo các bước cơ bản:

Giống ặ Hoạt hoá giống ặ Nhân giống các cấp ặ Lên men.

Giống thạch nghiêng được hoạt hoá trong môi trường giữ giống ở 28^OC trong 4 -5 ngμy rồi cấy vμo môi trường nhân giống cấp 1 vμ lắc 200 – 250 v/ph trong khoảng 48 giờ, tiếp tục nhân giống cấp 2 với lượng giống cấy truyền 2 - 4% (nếu trong bình nón) vμ tiếp tục nhân giống, lượng giống cấy vμo nồi lên men lμ 10 - 15%. Quá trình lên men kéo dμi khoảng 96 – 120 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 – 28^OC, pH môi trường 6,8 – 7,2. Cấp khí với lưu lượng 1 VVM.

Hiệu suất chủng lên men thường không ổn định do sản phẩm lμ một hỗn hợp nhiều loại gentamicin, có thể đạt tới 1500 mcg/ml hoặc cao hơn.

3.3.3. Chiết xuất vμ tinh chế

Dịch lên men được acid hoá bằng acid sulfuric 4N đến pH 2,0 – 2,5 để giải phóng các kháng sinh bám vμo khuẩn ty, bổ sung chất trợ lọc, khuấy trộn rồi lọc bằng lọc trống hay lọc ép khung bản lấy dịch lọc. Trung tính hoá dịch lọc bằng dung dịch NaOH 40%, loại ion Ca⁺⁺ bằngacid oxalic đến pH = 3 – 3,5.

Khuấy trộn rồi trung tính hoá lại đến pH = 7,0 – 7,5. Lọc loại tủa. Dịch lọc đã xử lý được chiết tách kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion (thường sử dụng Amberlit IRC50 đã được hoạt hoá ở dạng R-COO^–Na⁺). Sau khi cột bão hoμ rửa cột bằng nước đã khử ion, phản hấp phụ kháng sinh bằng dung dịch acid sulfuric 4N. Phân đoạn đậm đặc nhất được chỉnh về pH = 4,5 bằng trietylamin, tẩy mμu bằng than hoạt. Lọc loại than rồi dùng methanol tủa lấy sản phẩm thô với tỷ lệ dung dịch kháng sinh: methanol lμ 1:8,5. Lọc rửa tủa thô bằng methanol vμ aceton, sấy chân không ở 40^OC vμ 30 – 70 mmHg. Sản phẩm thu được lμ gentamicin thô ở dạng muối sulfat.

Quá trình tinh chế gentamicin thô được tiến hμnh như sau: Hoμ gentamicin sulfat thô vμo nước cất, chỉnh pH = 7,0 -7,5. Tẩy mμu bằng than hoạt (khoảng 5%). Dịch lọc được đem sắc ký trao đổi ion với nhựa cationit Amberlit CG50 dạng hoạt hoá NH₄. Phản hấp phụ bằng dung dịch NH₄OH 0,3N. Lấy phân đoạn đậm đặc nhất. Cô chân không. Tảy mμu bằng than hoạt.

Sau khi lọc loại than thì tủa kháng sinh bằng methanol. Rửa tủa bằng aceton.

Tinh thể sấy khô trong chân không ở 40^OC vμ 30 – 70 mmHg. Sản phẩm thu được đem đi kiểm nghiệm vμ đóng gói.

Tự lượng giá

1. Kể tên các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh nhóm aminoglycosid.

2. Tìm mối liên hệ giữa cấu trúc của streptomycin với thμnh phần môi trường lên men.

3. Nêu quy trình chiết xuất streptomycin từ môi trường lên men.

4. Nêu tên chủng vi sinh vật sinh gentamicin vμ trình bμy quy trình lên men sinh tổng hợp gentamicin?

Ch−¬ng 11