Phiếu kiểm nghiệm
4.3. Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử vi sinh vật
4.3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
•
•
•
Độ ẩm:
Hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến nước. Khi thiếu nước xảy ra hiện tượng loại nước khỏi tế bào vi sinh vật, trao đổi chất bị giảm, tế bào sẽ chết. Vì vậy, để bảo quản dược phẩm, dược liệu tránh khỏi tác động của vi sinh vật cần có một giới hạn độ ẩm nhất định.
ánh sáng:
ánh sáng mặt trời gồm các tia bức xạ như: tia tử ngoại, hồng ngoại, tia gamma có tác dụng phá huỷ tế bào vi sinh vật, đặc biệt là tia tử ngoại. Bức xạ UV bước sóng khoảng 260nm, có tác dụng diệt khuẩn mạnh nhất. Dưới ảnh hưởng của tia UV, vi sinh vật bị chết hoặc đột biến tuỳ theo liều lượng.
Để ngăn ngừa tác hại của vi sinh vật đối với thuốc các tác nhân vật lý trên cần được vận dụng trong quá trình sản xuất và bảo quản dược phẩm, nhằm hạn chế tối đa số lượng vi sinh vật gây nhiễm ban đầu. Đồng thời các chế phẩm dược phải được quy định giới hạn vi sinh vật cho phép.
Nguyên liệu pha chế môi trường phải đảm bảo chất lượng, hoá chất phải tinh khiết. Nếu là các dạng bột hoặc tinh thể phải khô, không đổi màu, không chảy nước.
•
•
•
•
•
Cân đong nguyên liệu:
Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hoá chất hoặc nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt…) phải được cân bằng cân phân tích.
Hoà tan nguyên liệu:
Thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường. Các hoá chất được hoà tan nóng hoặc lạnh tuỳ theo tính chất của chúng. Môi trường không có thạch nên hoà tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào.
Điều chỉnh pH:
Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45 - 50oC để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ sung nước cho đủ thể tích quy định.
Làm trong môi trường
Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hoà tan) phải trong để dễ quan sát sự phát triển của vi sinh vật. Sau khi hoà tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc qua vải gạc hoặc giấy.
Đóng ống tiệt trùng:
Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu, tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặc bình.
Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói. Nếu để lâu, tạp khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường.
Các môi trường thông thường được tiệt trùng 110oC/30 phút hoặc 120oC/
20 phút.
Môi trường có các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt, cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng phương pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn. Môi trường được lấy ra khỏi nồi hấp ngay sau khi tiệt trùng xong. Nếu để lâu trong nồi hấp môi trường bị chuyển màu và giảm chất lượng.
Pha chế môi trường từ hỗn hợp bột môi trường chế sẵn:
ở nhiều nước trên thế giới có các loại môi trường dưới dạng bột khô chứa đầy đủ các thành phần theo yêu cầu, các môi trường này được làm từ nguyên liệu, hoá chất tinh khiết nên chất lượng môi trường đảm bảo và ổn định. Khi làm thí nghiệm môi trường được pha với nước theo tỷ lệ quy định, nhưng phải
dùng nước mới cất hoặc nước khử khoáng, trung tính để pha chế. Nếu bột môi trường đã cũ cần phải kiểm tra lại pH sau khi làm môi trường.
4.3.2.2. Bảo quản môi trường
ư Môi trường bột khô được giữ ở 10 - 12oC trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
ư Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4 – 10oC trong 1 – 2 tháng tuỳ theo thành phần môi trường.
4.3.2.3. Các phương pháp tiệt trùng
Tiệt trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn vi sinh vật sống được. Tiệt trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý, hoá học.
Chọn phương pháp tiệt trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá và độ bền vững của môi trường.
•
•
•
Tiệt trùng bằng nhiệt khô:
Phương pháp này dùng để tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…
Điều kiện tiệt trùng là: 180oC/ 30 phút hoặc 170oC/ 1 giờ, hoặc 160oC/2 giờ.
Các dụng cụ thuỷ tinh để đóng môi trường phải được tiệt trùng khô trước khi dùng.
Tiệt trùng bằng hơi nước:
Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật.
ư Môi trường thường được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121oC/ 15 phút.
Các môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa, bia, máu, albumin… cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau:
ư Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall):
Môi trường được hấp 3 - 4 lần ở nhiệt độ không quá 100oC trong 30 - 40 phút, cách nhau 24 giờ. Giữa hai lần hấp cho môi trường vào ủ ở 28 - 32oC/ 24 giờ cho bao tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo.
ư Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur):
Đun cách thuỷ môi trường 60oC/ 30 phút, hoặc 73oC/ 15 phút sau đó làm lạnh đột ngột dưới 10oC. Phương pháp này không diệt được bào tử.
Phương pháp lọc:
Phương pháp lọc được dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt. Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22àm. Phần
chảy qua phễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được tiệt trùng trước khi dùng.
•
•
Phương pháp dùng tia bức xạ:
Tia tử ngoại (UV) được dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật.
Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và liều lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng.
Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm phương pháp dùng hoá chất để khử nấm.
4.3.3. Thử vô trùng