Phiếu kiểm nghiệm
4.3. Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử vi sinh vật
4.3.3. Thử vô trùng 1. Mục đích
chảy qua phễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được tiệt trùng trước khi dùng.
•
•
Phương pháp dùng tia bức xạ:
Tia tử ngoại (UV) được dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật.
Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và liều lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng.
Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm phương pháp dùng hoá chất để khử nấm.
4.3.3. Thử vô trùng
+ Vi khuẩn hiếu khí:
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
Pseudomonas aeruginosa + Vi khuẩn kỵ khí:
Clostridium sporogenes + Vi nấm:
Candida albicans Aspergillus niger
ống thử vi khuẩn được nuôi cấy 30 - 35oC/ 3 ngày, ống thử vi nấm ủ ở 25 - 28oC/ 5 ngày.
Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật phải phát triển tốt trên các môi trường.
4.3.3.4. Lấy mẫu thử
Trong thử vô trùng, có thể coi toàn bộ số ống hoặc lọ thuốc được khử trùng hoặc được phân bố vô trùng trong cùng một điều kiện là một lô thuốc.
Thông thường, khi một lô có ít hơn 100 đơn vị, lấy 3 đơn vị để kiểm nghiệm.
Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị lấy thêm một đơn vị nhưng không quá 10.
Tuy nhiên, khi lấy mẫu cũng cần phải dựa vào tiêu chuẩn ngành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp.
4.3.3.5. Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử
Một số thuốc trong quá trình sản xuất được thêm các chất bảo quản.
Những chất này có thể ảnh hưởng đến sự phát hiện vi sinh vật có trong chế phẩm.
Một chế phẩm chưa biết có tác dụng ức chế hay không thì cần phải kiểm tra tác dụng ức chế đối với các vi sinh vật sau:
Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm, cấy vào một trong hai ống chế phẩm cần thử.
Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch vi sinh vật được pha khoảng ở nồng độ thích hợp) Staphylococcus aureus (vi khuẩn hiếu khí), Clostridium sporogenes (vi khuẩn kỵ khí), Candida albicans (vi nấm) vào cả hai ống của các môi trường tương ứng. Nuôi cấy 30 - 35oC/4 ngày đối với vi khuẩn và 25 - 28oC/7 ngày đối với vi nấm.
Trong thời gian nuôi cấy, nếu vi sinh vật phát triển giống nhau (mọc nhanh và phong phú) trong cái ống chứng và ống kiểm tra, chế phẩm thử được coi là không có tác dụng ức chế.
Nếu các ống có chất thử, vi sinh vật phát triển yếu hoặc không phát triển so với ống không có chất thử, chế phẩm có chất ức chế.
Tác dụng ức chế của chất thử phải được loại bỏ bằng cách pha loãng, trung hoà, hoặc dùng phương pháp màng lọc.
4.3.3.6. Phương pháp thử
Thử vô trùng có thể được thực hiện theo hai phương pháp tuỳ theo tính chất của mẫu thử:
ư Phương pháp lọc qua màng lọc vi khuẩn . ư Phương pháp nuôi cấy trực tiếp.
•
•
•
Phương pháp dùng màng lọc:
Thiết bị lọc thường bằng thuỷ tinh, thép không rỉ hoặc nhựa gồm hai bộ phận có thể tháo rời, ở giữa có lưới đỡ màng lọc. Màng lọc có thành phần là nitrat celleulose thường dùng lọc nước, dầu, và dung dịch alcol yếu. Màng ecetat cellulose để lọc các dung dịch alcol mạnh. Lỗ màng lọc có nhiều kích thước khác nhau, trong thử vô trùng thường dùng màng có đường kính khoảng 50mm và đường kính lỗ màng lọc ≤ 0,45àm.
Thiết bị lọc và màng lọc phải được tiệt trùng trước khi thí nghiệm .
ư Dung dịch chất thử chảy qua màng lọc, các vi sinh vật được giữ lại trên màng, cấy màng lọc vào các môi trường thích hợp để phát hiện vi khuẩn, vi nấm.
ư Phương pháp màng lọc kiểm nghiệm được các thưốc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt là thuốc kháng sinh, nhưng đòi hỏi thiết bị tốt và điều kiện vô trùng cao.
Phương pháp nuôi cấy trực tiếp:
Phương pháp nuôi cấy trực tiếp có kỹ thuật đơn giản, nhưng khả năng phát hiện vi sinh vật giảm khi số lượng vi sinh vật có ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn. Phương pháp này không thực hiện được với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh, vì khi thí nghiệm chất thử được cấy trực tiếp vào các môi trường nuôi cấy thích hợp cho các vi khuẩn, vi nấm.
Lượng mẫu thử dùng trong thí nghiệm:
Lượng mẫu thử cần cấy vào các môi trường tuỳ thuộc vào từng loại mẫu (bảng 4.1.).
ư Chất lỏng là dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi trường nuôi cấy 1% tween 80 hoặc các chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp.
ư Mẫu thử là dạng mỡ hay kem được hoà loãng vào dung dịch pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ 1/10 trước khi cấy vào môi trường, (dung dịch pepton, cần thêm tween 80 với tỷ lệ 1ml/ 1lít).
Kỹ thuật thử:
•
ư Mẫu thử là dược phẩm:
Dùng dụng cụ vô trùng cấy trực tiếp chế phẩm thử vào các môi trường phát hiện vi khuẩn, vi nấm theo số lượng quy định. Chất rắn là dạng bột có thể cho trực tiếp vào môi trường hoặc làm thành dung dịch hay nhũ dịch 1%
sau đó cấy vào môi trường.
Bảng 4.1. Lượng mẫu thử dùng cho thí nghiệm nuôi cấy trực tiếp Lượng chế phẩm trong
một đơn vị đóng gói
Lượng tối thiểu cho một môi trường nuôi cấy
Thể tích môi trường (ml) - Chất lỏng:
Thể tích V < 1ml 1 ml ≤ V< 4 ml 4 ml ≤ V < 20ml 20ml ≤ V < 50ml 50ml ≤ V< 100ml V ≥ 100ml - Chất rắn:
Khối lượng P< 50mg
50mg < P< 200mg
P ≥ 200mg
Toàn bộ một ống 1/2 ống
2ml 5ml 10ml Thường 10%
Toàn bộ một đơn vị đóng gói 1/2 khối lượng của một đơn vị đóng gói
100mg
10 15 20 40 80 100
20
40
80
ư Mẫu thử là băng gạc, chỉ khâu phẫu thuật nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100ml môi trường.
ư Mẫu thử là dây truyền dịch: Cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng chảy qua để thu được ít nhất 15ml và cấy vào 100ml môi trường.
Môi trường phát hiện vi khuẩn được nuôi cấy ở 30 - 35oC ít nhất trong 4 ngày, và ở 25 - 28oC ít nhất trong 7 ngày đối với vi nấm.
(Mỗi loại môi trường làm 2 - 3 ống thử song song).
• Nhận định kết quả:
Mẫu thử được coi là vô trùng nếu sau thời gian nuôi cấy không có vi khuẩn, vi nấm phát triển.
Nếu có 1 hoặc nhiều ống có vi sinh vật mọc cần làm lại lần thứ hai (Trước khi làm lại thử nghiệm lần 2 cần phân lập xác định đặc tính hình thái của vi sinh vật ở các ống thử dương tính):
ư Nếu không có vi sinh vật → mẫu vô trùng.
ư Nếu có vi sinh vật giống với lần một → mẫu thử không vô trùng.
ư Nếu có vi sinh vật khác với lần một → thí nghiệm được làm lại lần 3 với số lượng mẫu gấp đôi:
+ Không có vi sinh vật phát triển → mẫu vô trùng.
+ Có vi sinh vật mọc → mẫu không vô trùng.