Các kỹ thuật HPLC

Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký loại cỡ (rây phân tử). Trong phạm vi cuốn sách, chủ yếu chúng tôi giới thiệu về sắc ký phân bố, vì đây là kỹ thuật HPLC được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc. Còn các kỹ thuật khác, chỉ có tính chất giới thiệu tóm tắt.

Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography) Pha tĩnh

Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt của các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác.

Các tiểu phân này thường có đường kính từ 3 đến 10 àm, cỡ hạt có thể tăng đến 50 àm hoặc lớn hơn cho sắc ký điều chế. Sắc ký dùng loại pha tĩnh này được gọi là sắc ký lỏng- lỏng (Liquid - liquid Chromatography - LLC). Nhưng kiểu pha tĩnh này có nhược điểm là bị rửa trôi dần theo dòng pha động. Kết quả, hiệu lực cột bị giảm dần trong quá trình sử dụng.

Để khắc phục nhược điểm trên, người ta đã sử dụng kỹ thuật sắc ký pha liên kết (Bonded- Phase Chromatography - BPC). Trong kỹ thuật này, pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang. Kỹ thuật này đã nhanh chóng trở thành kỹ thuật phổ biến nhất trong HPLC. Trong loại pha tĩnh này, các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol.

Tính phân cực của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết, chúng ở trong vùng từ nhóm không phân cực octadecyl silan đến nhóm rất phân cực nitril.

Dưới đây là một số pha liên kết thường dùng:

Octyl = Si- (CH₂₎)₇- CH₃ C₈ Octadecyl = Si- (CH₂₎)₁₇- CH₃ C₁₈ Phenyl = Si- (CH₂)_n- C₆H₅ C₆H₅ Cyanopropyl = Si- (CH₂)₃- CN CN Aminopropyl = Si- (CH₂)₃- NH₂ NH₂ Diol = Si- (CH₂)₃- OCH (OH) - CH₂- OH

Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc ký pha thuận. Ngược lại, pha động phân cực còn pha tĩnh không phân cực, được gọi là sắc ký pha đảo.

ư Khi sử dụng silica, nhôm oxyd hoặc polyme xốp thì các chất được phân tách theo cơ chế hấp phụ nên được gọi là sắc ký hấp phụ.

ư Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký trao đổi ion .

ư Nếu pha tĩnh là polyme xốp như dextran..., ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử Size Exclution Chromatography).

Pha động

ái lực của một thành phần đối với pha tĩnh hay nói một cách khác, thời gian lưu giữ của nó ở trên cột được điều khiển bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2, 3 hay 4 thành phần. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp. Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi trong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giải gradient hoặc chương trình hóa dung môi.

Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo):

* Sắc ký pha thuận (normal phase):

Trong kỹ thuật này người ta sử dụng chất nạp cột (packings) gồm các nhóm phân cực liên kết với chất mang như nhóm alkylnitril [-(CH₂)_nCN ] và alkylamin [-(CH₂)_nNH₂]. Dung môi sử dụng là dung môi của sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn - LSC). Kỹ thuật này, sử dụng pha tĩnh phân cực hơn pha động, được gọi là sắc ký phân bố pha thuận. Sự phân tách đạt được bằng sắc ký pha thuận cũng tương tự như ở LSC. Song pha tĩnh trong sắc ký pha liên kết có ưu điểm hơn pha tĩnh trong LSC:

. Cột nhanh đạt cân bằng nên rất thuận lợi cho phân tách gradient.

. Cột thích hợp với nhiều dung môi và dễ tái sinh.

. Cột rất bền.

. Cột alkylamin có thể có chức năng như một cột trao đổi anion yếu.

Pha động trong sắc ký pha thuận nói chung không phân cực, thường dùng hỗn hợp của các hydrocarbon mạch thẳng như pentan, hexan, heptan, isootan. Các dẫn chất halogen dãy béo cũng được sử dụng như: diclorometan, dicloroetan, butyl clorid và cloroform. Có thể thêm vào các pha khan nước này 1- 2% acid acetic hoặc phosphoric để ngăn cản sự ion hóa của các chất như: các phenol, acid carboxylic. Ngược lại, sự ion hóa của các base yếu có thể được kìm lại bằng cách thêm một lượng nhỏ amoniac hoặc một amin khác (0,1- 1%).

Ngoài ra cũng có thể thêm vào pha động những chất cải biến hữu cơ (organic modifier) khác như các alcohol, tetrahydrofuran.

Nói chung, việc đuổi khí hòa tan không thành vấn đề với dung môi pha thuận.

Trong kỹ thuật sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm. Thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử.

Ví dụ: Tách hỗn hợp steorid bằng sắc ký pha thuận.

Điều kiện sắc ký:

- Cột: MicroPak – NH₂ 2,2 x 150 mm, 5 àm.

- Pha động: hexan chứa 0,2% isopropanol.

- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.

- Detector: UV 254 nm

phút

Hình 3.6: Sắc đồ tách các steroid

1- Progesterone 5- Andrenosterone

2- Androstendione 6- Cortisone acetat 3- ∆⁴- pregnon-20-β-ol-one 7- Cortisone 4- 17-α-hydroxyprogesterone 8- Hydrocortisone

* Sắc ký pha đảo (reversed phase) :

Trong kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp HPLC, sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng nhiều nhất.

Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không phân cực như octadecyl (C₁₈), octyl (C₈) hay phenyl (C₆H₅). Pha động là những dung môi phân cực như: nước, methanol (MeOH), acetonitril (ACN). Tóm lại, pha động phân cực hơn pha tĩnh.

Độ chọn lọc của kỹ thuật này khác biệt đáng kể với quá trình tách trên pha thuận. Người ta thấy rằng, một chất càng tan tốt trong nước thì nó được rửa giải khỏi cột càng nhanh. Quy tắc rửa giải này ngược với pha thuận.

Với các chất được rửa giải quá sớm trong sắc ký pha thuận, chúng sẽ rất khó tách rời khỏi nhau. Trong khi đó, ở pha đảo các thành phần này sẽ được rửa giải vào gần cuối của quá trình sắc ký làm cho việc tách dễ dàng hơn (có nghĩa là k^’ lớn hơn).

Khi một pic nhỏ được rửa giải sau một pic lớn thì thường rất khó định lượng bằng sắc ký pha thuận. Tuy nhiên dãy rửa giải có thể đảo ngược lại bằng cách dùng sắc ký pha đảo. Khi đó pic nhỏ có thể được xác định chính xác hơn.

Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký pha đảo là nước. Những dung môi hòa lẫn được với nước như methanol, ethanol (EtOH), acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran (THF) và dimethylformamid được thêm vào để điều chỉnh độ phân cực của pha động. Một số thành phần khác cũng có thể được thêm vào pha động như: các acid, base, đệm , chất diện hoạt.

Cặp dung môi được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là:

H₂O - MeOH và H₂O – ACN. Điều dễ nhận thấy, MeOH có nhược điểm là độ nhớt cao của nó có thể làm giảm hiệu lực cột. Trong khi ACN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp hơn với các chất không phân cực vì thế nó thường được dùng nhiều hơn MeOH. Thời gian lưu sẽ ngắn hơn nếu nồng độ ACN bằng nồng độ MeOH.

Chú ý: Khi pha động có thêm các muối vô cơ hoặc các chất hoạt động bề mặt, nên lọc nó trước khi dùng vì có thể có cặn không tan trong nước gây bẩn cột.

Việc đuổi khí rất quan trọng với pha động pha đảo.

Về thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước, các chất ít và không phân cực ra sau.

Ví dụ: Tách hỗn hợp morphin, codein và heroin bằng HPLC pha đảo (hình 3.7).

Điều kiện sắc ký:

- Cột: Zorbax Rx, Sb- C 8, 4,6 x 150 mm, 5àm.

- Pha động: ACN/KH₂PO₄ 25 mM, pH 3,5 7/ 93.

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Detector: UV 254 nm

Hình 3.7: Sắc đồ tách morphin, codein, heroin.

Phút

1 - Morphin 2 - Codein 3 - Heroin.

Sắc ký cặp ion (Ion-Pair Chromatography IPC)

Sắc ký cặp ion dựa trên cơ sở sự tạo thành cặp từ ion cần phân tích mang điện và tác nhân tạo cặp mang điện trái dấu (đối ion).

[ ]

_hc

n

n Q XQ

X^ư + ⁺ =

Nhìn chung, IPC thực chất là HPLC pha đảo.

Dung môi: Chính là dung môi trong pha đảo, thường phối hợp H₂ O-MeOH và H₂O-ACN. Điểm quan trọng nhất là phải đảm bảo rằng thuốc thử tạo cặp ion đã tan hết trong pha động để tránh kết tủa trong hệ thống.

Đối ion: Đối ion thường là các amin bậc 4 hoặc các muối sulfonat. Cần phải điều chỉnh pH của pha động với đệm tới giá trị thích hợp. Đồng thời phải kiểm tra độ tan của đệm trong dung môi trước khi bơm qua hệ sắc ký.

Cột: Dùng các chất nạp pha đảo với các nhóm alkyl C₂, C₈, và C₁₈....

Ví dụ: Tách hỗn hợp vitamin tan trong nước bằng HPLC cặp ion pha đảo.

Điều kiện sắc ký:

- Mẫu thử: Vitamin tan trong nước.

- Cột: Zorbax SB C 8, 4,6 x 150 mm, 5 àm.

- Pha động: ACN/ MeOH/ diethylamin 2%/ acid acetic 2%

(2/ 3/ 4/ 28) và 1,1 g Na heptan sulfonat/ lit.

- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.

- Detector: UV 280 nm

Màu 100

88 66

48 28 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 n

DAD1 A, Sig = 280, 4 Ref = 360,100 1

2

3

4 1

7.059

5.583

3.272

2.151

Hình 3.8: Sắc đồ tách hỗn hợp vitamin tan trong nước.

1. Vitamin PP 2. Vitamin B₆ 3. Vitamin B₂ 4. Vitamin B₁

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (Liquid – Solid Chromatography LSC).

Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến. Trong kỹ thuật này, chất cần phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).

Pha tĩnh có thể là silicagel, nhôm oxyd ... nhưng silicagel được dùng nhiều hơn. Pha động thường là những dung môi ít hoặc không phân cực. Khi rửa giải, các chất không phân cực sẽ ra trước, các chất càng phân cực càng ra chậm.

Ví dụ: Tách hỗn hợp steroid acetat bằng HPLC hấp phụ Điều kiện sắc ký:

- Mẫu thử: Hỗn hợp steroid acetat

- Cột: LiChrosorb Si 60 4,6 x 250 mm, 7 àm.

- Pha động: Chloroform/ methanol 95,5/ 0,5.

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút - Detector: 254 nm

Hình 3.9: Sắc đồ tách hỗn hợp steroid acetat 1. 11- Deoxycorticosteron 4. Hydrocortison

2. Cortison 5. Prednisolon

3. 9 α- Fluorohydrocortison acetat

Sắc ký trao đổi ion (Ion – Exchange Chromatography IEC)

Sắc ký trao đổi ion được dùng để phân tách các thành phần ion hóa tan trong nước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500. Pha tĩnh là các nhựa trao đổi ion dưới dạng bột mịn. Đó là những hợp chất hữu cơ cao phân tử có chứa nhóm chức có khả năng trao đổi.

ư Nhựa có nhóm hoạt động mang điện tích âm, dùng để tách các chất base như các amin.

ư Nhựa có nhóm hoạt động tích điện dương để phân tách các chất có nhóm mang điện âm, như các nhóm phosphat, sulfonat, carboxylat.

pH của pha động, nhiệt độ, loại ion, nồng độ ion, và các chất cải biến hữu cơ ảnh hưởng đến cân bằng, nhưng có thể điều chỉnh được để thu được kết quả tách mong muốn.

Sắc ký loại cỡ (Size Exclusion Chromatography SEC)

Phương pháp SEC được ứng dụng chủ yếu để phân tách các chất có phân tử lượng (MW) lớn hơn 2000. Pha tĩnh là những hạt xốp của silicagel hay polyme.

Khi sắc ký, các phân tử của các chất phân tích được lọc theo cỡ của khối lượng phân tử. Khi cho hỗn hợp cần phân tách qua cột, ta thấy:

ư Các phân tử có MW quá lớn, chạy nhanh qua cột, chúng không bị lưu giữ.

ư Các phân tử có MW nhỏ hơn thì bị lưu giữ trên cột. Khi rửa giải chúng sẽ lần lượt ra khỏi cột với thời gian lưu tăng theo chiều giảm của khối lượng phân tử.

Trong tài liệu Kiểm nghiệm d−ợc phẩm (Trang 89-95)